[目的]本课题组前期已经证实:在博来霉素诱导小鼠肺纤维化中,观察到Sesn2的表达下调,Sesn2可减轻博来霉素诱导小鼠肺纤维化严重程度。但Sesn2具体通过何种机制影响肺纤维化尚不清楚。本研究拟从谷氨酰胺代谢角度阐明Sesn2在肺纤维化形成过程中的作用,旨在观察Sesn2是否通过调控谷氨酰胺代谢影响肺纤维化的形成,从而全面研究Sesn2在肺纤维化中的作用机制。为寻找新的肺纤维化的治疗靶点提供理论依据。[方法]1.动物实验部分30只6-8周龄C57BL/6健康雄性小鼠,给予适应性饲养1周后,随机分为对照组（NC组）、博来霉素组（BLM组）、Sesn2过表达组（BLM+Ad-Sesn2组）。依据分组给予相应干预,对于Sesn2过表达组,给予气管内滴注Sesn2过表达载体（1×108 PFU/50μL/只）,NC组、BLM组给予等量生理盐水。在给予滴注Sesn2过表达载体72小时后,BLM组和Sesn2过表达组按博来霉素5mg/kg量（溶于50ul生理盐水中）,经气管内滴注给药,NC组小鼠气管内滴注生理盐水（50ul）。28天后小鼠采用颈椎脱臼法处死。通过酶联免疫吸附试验（Elisa）检测肺组织中谷氨酰胺、谷氨酸的表达。通过Western blot法检测谷氨酰胺酶（GLS）的表达。研究Sesn2对BLM诱导小鼠肺纤维化中谷氨酰胺代谢的影响。2.细胞实验部分2.1培养人胚肺成纤维细胞（MRC-5）,根据分组转染过表达或抑制的Sesn2载体至MRC-5细胞中,同时转染Ad-GFP、Scramble为对照,再加入转化生长因子-β1（TGF-β1）80ng/mL 或不加 TGF-β1 诱导 MRC-5 细胞,设置 Scramble组、Scramble+TGF-β1 组、si-Sesn2 组、si-Sesn2+TGF-β1 组、Ad-GFP 组、Ad-GFP+TGF-β1 组、Ad-Sesn2 组、Ad-Sesn2+TGF-β1 组。通过 Elisa 法检测谷氨酰胺、谷氨酸的表达。通过Western blot检测GLS的表达。研究Sesn2对TGF-β1诱导MRC-5细胞中谷氨酰胺代谢的影响。2.2培养MRC-5细胞,根据分组转染过表达或抑制的Sesn2载体至MRC-5细胞中,同时转染Ad-GFP、Scramble为对照,加谷氨酰胺酶抑制剂（CB839）1μM或不加CB839预处理细胞1小时,再加TGF-β1 80ng/mL诱导MRC5细胞,设置 Ad-GFP+TGF-β1 组、CB839+Ad-GFP+TGF-β1 组、Ad-Sesn2+TGF-β1 组、CB839+Ad-Sesn2+TGF-β1 组、Scramble+TGF-β1组、CB839+Scramble+TGF-β1组、Si-Sesn2+TGF-β1 组、CB839+Si-Sesn2+TGF-β1 组。通过 CCK8 实验检测细胞增殖能力,通过Western blot检测Ⅰ型胶原蛋白（COL-I）,Ⅲ型胶原蛋白（COL-Ⅲ）,α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达情况,定量实时聚合酶链锁反应（Q-PCR）检测COL-ⅠmRNA、COL-ⅢmRNA的表达情况,免疫荧光检测α-SMA表达情况。研究Sesn2通过谷氨酰胺代谢途径对TGF-β1诱导MRC-5细胞增殖、胶原分泌及转化的影响。通过Western blot检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷蛋白70核糖体蛋白S6激酶（P70S6K）和其磷酸化水平的表达。研究Sesn2通过谷氨酰胺代谢对mTOR信号通路的影响。[结果]1.在BLM诱导的小鼠肺纤维化模型中,Sesn2调控谷氨酰胺代谢途径通过Elisa法检测NC组、BLM组、Sesn2过表达组中谷氨酰胺及谷氨酸的表达,结果显示与NC组比较,BLM组谷氨酰胺、谷氨酸的表达明显升高,过表达Sesn2可逆转BLM诱导小鼠肺纤维化中谷氨酰胺、谷氨酸的升高。通过Western blot检测谷氨酰胺酶的表达,结果显示与NC组比较,BLM组谷氨酰胺酶的表达升高,过表达Sesn2可抑制博来霉素诱导小鼠肺纤维化中谷氨酰胺酶的升高。提示:在BLM诱导的小鼠肺纤维化中,谷氨酰胺摄取增加,谷氨酰胺向谷氨酸转化增加;过表达Sesn2可减少谷氨酰胺的摄取,抑制谷氨酰胺向谷氨酸转化。2.在TGF-β1诱导MRC-5细胞模型中,Sesn2调控谷氨酰胺代谢的表达通过Elisa法检测在转染Ad-Sesn2或Si-Sesn2后,TGF-β1诱导MRC-5细胞中谷氨酰胺、谷氨酸的表达。结果显示:在TGF-β1诱导MRC-5细胞中,谷氨酰胺、谷氨酸的表达水平升高;过表达Sesn2可逆转TGF-β1诱导MRC-5细胞中谷氨酰胺、谷氨酸水平升高;相反,抑制Sesn2可使TGF-β1诱导MRC-5细胞中谷氨酰胺、谷氨酸的水平进一步升高。通过Western blot检测GLS的表达,结果显示:在TGF-β1诱导MRC-5细胞中,GLS的表达升高;过表达Sesn2可逆转TGF-β1诱导MRC-5细胞中GLS升高;相反,抑制Sesn2可使GLS的表达进一步升高。提示:在TGF-β1诱导MRC-5细胞中,谷氨酰胺摄取增加,谷氨酰胺向谷氨酸转化增加,过表达Sesn2可减少谷氨酰胺摄取,减弱谷氨酰胺向谷氨酸转化。抑制Sesn2可促进谷氨酰胺摄取,促进谷氨酰胺向谷氨酸转化。3.Sesn2通过谷氨酰胺代谢途径对TGF-β1诱导MRC-5细胞增殖、胶原分泌、转化的影响通过CCK8实验检测细胞增殖能力,结果显示:在TGF-β1诱导MRC-5细胞中,过表达Sesn2使细胞增殖力下调,再给予CB839干预后,细胞增殖能力进一步下调。抑制Sesn2使细胞增殖力显著增强,再给予CB839干预,细胞增殖力下调。通过Western blot检测各组纤维化标志物COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA蛋白的表达水平,结果显示:在TGF-β1诱导MRC-5细胞中,过表达Sesn2使COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA 蛋白表达下调,给予 CB839 干预后,COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA蛋白下调更加明显。然而,在TGF-β1诱导MRC-5细胞中,抑制Sesn2使COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA蛋白表达上调,再给予CB839干预,上述趋势被逆转。Q-PCR检测COL-ⅠmRNA、COL-ⅢmRNA及免疫荧光观察α-SMA结果与Western blot结果一致。提示过表达Sesn2可抑制TGF-β1诱导MRC-5细胞中胶原分泌及转化,抑制谷氨酰胺酶,可进一步抑制细胞中胶原分泌及转化;抑制Sesn2可促进TGF-β1诱导MRC-5细胞中胶原分泌及转化,抑制谷氨酰胺酶,可减弱细胞中胶原分泌及转化。4.Sesn2通过谷氨酰胺代谢途径对TGF-β1诱导MRC-5细胞中mTOR通路的影响通过Western blot检测各组细胞中mTOR、P70S6K和其磷酸化水平的表达,结果显示:在TGF-β1诱导MRC-5细胞中,过表达Sesn2使p-mTOR以及p-P70S6K蛋白表达降低,再给予CB839处理后,p-mTOR以及p-P70S6K蛋白表达下调更加明显;然而,在TGF-β1诱导MRC-5细胞中,抑制Sesn2使p-mTOR、p-P70S6K蛋白表达上调,这种上调可被CB839逆转。说明过表达Sesn2可抑制TGF-β1诱导MRC-5细胞中mTOR活化,再给予谷氨酰胺酶抑制剂干预,可进一步抑制mTOR活化;抑制Sesn2可促进TGF-β1诱导MRC-5细胞中mTOR活化,再给予CB839干预,减弱了 mTOR活化。[结论]1.在BLM诱导的小鼠肺纤维化模型中,谷氨酰胺代谢途径增强,过表达Sesn2抑制谷氨酰胺代谢途径。2.在TGF-β1诱导MRC-5细胞中证实Sesn2抑制谷氨酰胺代谢途径。3.Sesn2通过抑制谷氨酰胺代谢抑制TGF-β1诱导MRC-5细胞增殖、胶原分泌及转化。4.Sesn2通过谷氨酰胺代谢途径抑制mTOR活化抑制TGF-β1诱导MRC-5细胞肺纤维化过程。