高产bacillomycin菌株选育及其大米防霉变研究

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xiaohan521325
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枯草芽孢杆菌fmbJ(Bacillus subtilis fmbJ)由本实验室自主分离筛选获得,针对该菌株已经开展了大量的研究,包括抑菌谱、发酵工艺、抗菌脂肽结构鉴定和抑菌机制等。该菌株能够产生多种抗菌脂肽,例如surfactin、fengycin和bacillomycin,这些物质在农业、医药和食品领域具有重要的应用潜力。Bacillomycin结构与iturin类似,碳链长度为C14-C17,与其它抗菌脂肤相比,它对真菌尤其是黄曲霉有着较强的抑制作用,目前在植物病原菌的防治方面取得了 一定的成就。但是,枯草芽抱杆菌fmbJ产bacillomycin的量较低,使其不能被大规模的生产,严重限制了它的发展以及应用空间。本研究以枯草芽孢杆菌fmbJ为出发菌株,对其先进行理化诱变以及复合诱变的选育,然后在诱变育种的基础上进行原生质体融合的选育,从而获得一株高产Bacillomycin的菌株,并实现其在防治大米黄曲霉霉变方面的应用。以下为本研究所得到的结果:1.通过物理诱变、化学诱变以及复合诱变对枯草芽孢杆菌fmbJ进行选育,获得高产抗菌肽bacillomycin的突变菌株。在使用紫外线以及氮离子注入方法对菌株进行诱变时,根据其致死率以及正突变率结果的变化,确定了紫外诱变的最佳处理时间为80 s,氮离子的最佳注入剂量为1000×1012 ions/cm2。在使用NTG以及EMS对菌株进行化学诱变时,根据其致死率以及正突变率结果的变化,确定了 NTG以及EMS的最佳作用浓度分别为800μg/mL和1.0 mol/L。在EMS以及紫外线的双重处理下,当EMS的作用浓度为0.6 mol/L、紫外照射时间为60 s时,菌株的致死率最高,且比单一因素诱变的效果要好。通过紫外诱变、氮离子诱变以及EMS-UV复合诱变筛选到三株高产抗菌肽bacillomycin且遗传性状稳定的菌株,其编号分别为:UV60-4、N84以及EMS-UV-43,其中UV60-4的产量提高最多,产量为306.31 mg/L,是出发菌株的1.32倍。2.对诱变得到两株高产bacillomycin的菌株UV60-4以及N84进行原生质体融合技术研究。原生质体的最佳制备与再生条件为:亲本菌株在完全培养基中二次培养了 6 h至对数生长中后期;溶菌酶浓度为0.1 mg/mL;酶解温度37℃;酶解时间10 min。酶解后的菌株的原生质体形成率均大于95%,再生率都达到22.5%以上。确定了原生质体灭活的条件:热灭活条件为沸水浴90 min;紫外灭活的条件为紫外照射120 min(30W,15 cm)。通过原生质体融合子的筛选,得到一株高产bacillomycin的融合子UV-N-61,其产量达到344.71 mg/L,是原始对照菌株的1.39倍,较融合前诱变的菌株产量提高了 12.54%。3.在防治大米黄曲霉霉变的研究中,确定了有效防治霉变的bacillomycin添加量。将不同浓度bacillomycin处理过大米放在温度为37℃、加水量为6mL、黄曲霉(3.3×103 cfu/mL)接种量为500μL的条件下模拟储藏15天,可以得出:当向大米中添加0.15 mg/g的bacillomycin时,大米的感官性质良好,霉菌总含量为1.7×104cfu/g,脂肪酸的含量为61.34KOH/100g干基,并未发生霉变,所以0.15 mg/g的bacillomycin的添加可以有效的抑制大米黄曲霉霉变。
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