[研究背景]银屑病是一种由多基因遗传决定的、多环境因素刺激诱导的免疫异常性慢性炎症性增生性皮肤病,其特征是表皮的过度增生、角化异常、血管新生、免疫激活与炎症反应。而系统性硬皮病是一种结缔组织性疾病,以胶原纤维的过度增生、血管改变和抗多种细胞抗原的自身抗体的产生为主要特征。两种疾病的发病机制都尚未明确,但研究表明都与促炎症的细胞因子,如白介素(Interleukin, IL)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、转移生长因子(transforming growth factor, TGF)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)等有关。众所周知,银屑病角质形成细胞存在角化过度和角化异常,但具体机制尚不十分明确。同时,最新研究表明,硬皮病角质形成细胞也存在角化延迟。Involucrin是角质形成细胞终分化的早期标志,在正常人表皮中主要表达于棘细胞上层和颗粒层。而在银屑病患者的表皮中,Involucrin位于除基底细胞层和角质层的表皮全层,表达量也大大增加。Involucrin在硬皮病表皮内的表达和分布尚无相关的报道。另一方面,硬皮病成纤维细胞的激活是造成真皮内胶原沉积的主要原因,因此长期以来对硬皮病的研究焦点在于真皮的成纤维细胞。TGF-β是最强大的促纤维化的细胞因子之一,在慢性纤维化疾病中参与成纤维细胞的激活,在胶原生产中起到关键作用。VEGF参与硬皮病发病,在硬皮病患者血清和皮肤受累部位含量都增加。然而,这些促炎症的细胞因子是如何通过信号转导通路发挥作用的尚不明确。银屑病研究的主要靶细胞是表皮角质形成细胞,有研究表明,皮肤成纤维细胞和角质形成细胞的相互作用是银屑病发病机制之一。由血管内皮细胞分泌的VEGF和血管生成素是银屑病血管新生和功能异常的主要原因。银屑病患者体内过表达TGF-β1,而对(K5.TGFβ1)野生型转基因鼠的研究中发现,此转基因鼠皮肤产生了银屑病样的炎症反应。但这些促炎症的细胞因子对银屑病成纤维细胞的作用和相关机制的研究尚不充分。因此,我们采用银屑病、硬皮病和正常人的角质形成细胞和成纤维细胞为研究对象,探讨炎症细胞因子在银屑病和硬皮病发病机制中的作用和可能的机制。[目的]明确在银屑病角质形成细胞中存在角化异常的机制；阐明硬皮病角质形成细胞中角化延迟的原因以及可能的信号传导通路的作用；明确导致银屑病成纤维细胞功能异常的相关分子及可能的信号转导通路的作用；阐明硬皮病成纤维细胞异常激活的相关分子及相关机制。[方法]第一部分：间接免疫荧光法检测Involucrin在正常表皮和银屑病皮损的表达和定位；分离和培养正常人和银屑病患者表皮角质形成细胞,以Western Blot法比较Involucrin在正常人和银屑病患者表皮角质形成细胞中表达；将炎症细胞因子(如IL-13、IL-17A、TNF-α等)及ERK1/2和GSK-3β信号转导通路抑制剂与体外培养的角质形成细胞共孵育,以Western Blot去比较炎症细胞因子和信号通路抑制剂对Involucrin在正常人和银屑病患者表皮角质形成细胞中表达的影响。第二部分：间接免疫荧光法检测Involucrin在正常表皮和硬皮病皮损的表达和定位；分离和培养正常人和硬皮病患者表皮角质形成细胞,以间接免疫荧光法检测Involucrin在细胞中的表达和定位；与炎症细胞因子(IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、 IL-17A、TNF-α、TGF-β1、ET-1、IL-13、IFN-γ、VEGF165、PDGF-BB)共培养,以Western Blot法比较炎症细胞因子对Involucrin在正常人和硬皮病患者表皮角质形成细胞中表达的影响；将炎症细胞因子(IL-13、ET-1和IFN-γ等)及Rho信号转导通路抑制剂与体外培养的角质形成细胞共孵育,以Western Blot去比较炎症细胞因子和信号通路抑制剂对Involucrin在正常人和硬皮病患者表皮角质形成细胞中表达的影响。第三部分：分离和培养正常人和硬皮病患者真皮成纤维细胞,以Western Blot法比较炎症细胞因子(VEGF165、IFN-γ和TGF-β)及ERK1/2和GSK-3β信号转导通路抑制剂对FN、CTGF和pAKT蛋白在正常人、银屑病和硬皮病患者真皮成纤维细胞中表达的影响。[结果]1Involucrin在银屑病表皮和正常表皮的表达和调控：1)在正常表皮中,Involucrin主要表达于颗粒层和棘细胞上层,而在银屑病皮损区表皮中,Involucrin表达于除基底层和角质层外的表皮各层细胞；2)体外培养的银屑病角质形成细胞和正常角质形成细胞相比,中Involucrin的表达明显升高；3)在体外培养的银屑病和正常角质形成细胞中,当ERK1/2信号转导通路或GSK-3β信号转导通路抑制后,Involucrin蛋白的表达都明显增加；4) IL-13、IL-17A、ET-1、TNF-α、IFN-γ均可促进银屑病患者与正常对照原代培养的表皮角质形成细胞中Involucrin蛋白的表达。然而,银屑病与正常对照的表皮角质形成细胞对不同细胞因子的反应不同；5) ERK1/2信号转导通路被抑制后,IL-13(只在正常对照角质形成细胞中)、IL-17A、ET-1、TNF-α和IFN-γ不能促进银屑病与正常表皮角质形成细胞Involucrin蛋白的表达。在银屑病角质形成细胞中,IL-13甚至可以抑制Involucrin蛋白的表达；6)在正常角质形成细胞中,当GSK-3β被抑制后,IL-13、ET-1和TNF-α仍然可以促进Involucrin蛋白的表达,而几-17A和IFN-γ可降低Involucrin蛋白的表达。在银屑病角质形成细胞中,IL-17A和IFN-γ可以显著降低Involucrin蛋白的表达,而IL-13、ET-1和TNF-α对银屑病角质形成细胞Involucrin蛋白的表达没有作用。2Involucrin在硬皮病表皮和正常表皮的表达和调控：1)在正常对照表皮和硬皮病患者表皮中,Involucrin局限在颗粒层和棘细胞上层,基底层和基底上棘细胞层没有表达；2)体外培养的硬皮病角质形成细胞与正常角质形成细胞相比,Involucrin的表达明显下降；3)体外培养的正常角质形成细胞Involucrin主要位于核周,而硬皮病角质形成细胞中Involucrin主要位于核内。同时,在硬皮病角质形成细胞中,Involucrin的荧光轻度明显减低；4)在正常角质形成细胞中,IL-6、I1-10、IL-17A、TNF-α,尤其是TGF-β1、 ET-1、IFN-γ、VEGF165和PDGF-BB,可以促进Involucrin蛋白的表达。而在硬皮病角质形成细胞中,IL-1β、IL-6、IL-10、TGF-β1、ET-1、IFN-γ、 VEGF165和PDGF-BB可降低Involucrin蛋白的表达,而IL-4、IL-17A、 TNF-α可促进Involucrin蛋白的表达；5) Rho信号转导通路对硬皮病和正常人体外培养的角质形成细胞Involucrin蛋白的表达无影响；6)抑制Rho信号转导通路,可以逆转IFN-γ对正常角质形成细胞Involucrin的促表达；而在硬皮病角质形成细胞则可以逆转IL-13对Involucrin的促表达,同时可以进一步促进IFN-γ对Involucrin蛋白表达的抑制作用。3ECM在银屑病、硬皮病患者和正常人皮肤成纤维细胞中的表达和调控：1) TGF-β1可上调银屑病、硬皮病和正常人皮肤成纤维细胞FN的表达,且不受ERK1/2和GSK-3β信号转导通路的影响；2) VEGF165可上调银屑病和正常人皮肤成纤维细胞FN的表达,但对硬皮病成纤维细胞FN表达无作用；ERK1/2信号转导通路被抑制后,VEGF165可促进硬皮病成纤维细胞FN蛋白的表达；GSK-3β信号转导通路被抑制后,VEGF165对正常成纤维细胞FN蛋白的作用被逆转；3) IFN-γ可上调正常人皮肤成纤维细胞FN的表达,但对银屑病和硬皮病成纤维细胞FN表达无作用；ERK1/2信号转导通路被抑制后,IFN-γ可极大促进正常成纤维细胞FN蛋白的表达；GSK-3β信号转导通路被抑制后,IFN-γ由促进转为抑制正常成纤维细胞FN的表达,同时可促进银屑病成纤维细胞FN表达；4) TGF-β1可极大促进银屑病、硬皮病和正常CTGF的表达,而VEGF165和IFN-y则对CTGF蛋白的表达没有作用。当ERK1/2和GSK-3p信号转导通路被抑制后,TGF-β1仍促进CTGF蛋白的表达,VEGF165和IFN-γ仍对CTGF蛋白的表达没有作用；5) VEGF165可上调正常人皮肤成纤维细胞AKT的磷酸化,但对银屑病和硬皮病成纤维细胞AKT的磷酸化无作用；ERK1/2信号转导通路被抑制后,VEGF165可增加银屑病和硬皮病成纤维细胞AKT的活性；GSK-3β信号转导通路被抑制后,VEGF165可抑制正常人和银屑病成纤维细胞AKT的活性；6) IFN-γ可上调银屑病和正常人皮肤成纤维细胞AKT的磷酸化；ERK1/2信号转导通路被抑制后,IFN-y可增加硬皮病成纤维细胞AKT的活性；GSK-3p信号转导通路被抑制后,IFN-γ可抑制银屑病成纤维细胞AKT的活性；7) TGF-β1可极大促进银屑病、硬皮病和正常皮肤成纤维细胞AKT的磷酸化,且不受ERK1/2和GSK-3p信号转导通路的影响。[结论]1、银屑病表皮和原代培养的角质形成细胞Involucrin的表达均增加；2、ERK1/2和GSK-3β信号转导通路可抑制表皮的异常角化；3、细胞因子IL-13、IL-17A、ET-1、TNF-α和IFN-γ可通过ERK1/2和GSK-3β信号转导通路调节银屑病和正常对照角质形成细胞Involucrin蛋白的表达；4、ERK1/2和GSK-3β信号转导通路在细胞因子IL-13、IL-17A、ET-1、TNF-α和IFN-γ调节银屑病和正常对照角质形成细胞Involucrin蛋白的表达上作用不同；5、硬皮病表皮的终分化是延迟的；6、硬皮病表皮终分化延迟可能与硬皮病患者血清或皮损内炎症细胞因子,如IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β1、ET-1、IFN-γ、VEGF165和PDGF-BB的水平升高有关；7、 Rho信号转导通路对正常和硬皮病角质形成细胞Involucrin蛋白表达没有作用,但可以影响IFN-γ和IL-13对Involucrin蛋白的调节；8、VEGF165、IFN-γ和TGF-β1可通过ERK1/2和GSK-3β信号转导通路调节正常人、银屑病和硬皮病成纤维细胞FN蛋白的表达和AKT的磷酸化；9、正常人、银屑病和硬皮病成纤维细胞中CTGF蛋白表达受TGF-β1调控,且不通过ERK1/2和GSK-3β信号转导通路起作用；10、表型不同的同一种类型的细胞,可能对同样的细胞因子的反应会不同,甚至完全相反。