研究背景及目的：病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）以心肌细胞的变性、坏死及单个核细胞的浸润为特征，是儿科心血管系统常见疾病，临床表现为不同程度的心功能障碍和全身症状。部分可转化为扩张性心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM），出现进行性心力衰竭，虽然应用免疫抑制治疗后能够存活较长一段时间，但最终仍需要进行心脏移植，成为青少年患病和死亡的主要原因之一。到目前为止VMC发生发展，并演变为DCM的病理机制仍不很清楚。研究表明病毒感染后，病毒直接引起细胞损害、病毒所诱导产生的自身免疫反应及病毒的持续存在都与其密切相关，其中病毒感染后的自身免疫机制对VMC的发展起着更为重要的作用，成为目前国内外研究的热点。国外学者用纯化的心肌肌凝蛋白免疫易感鼠种产生实验性自身免疫性心肌炎（experimental autoimmune myocarditis，EAM），这种心肌炎与人类心肌炎类似并可发展成为DCM。为探讨心肌炎自身免疫反应的机制以及探索新的防治措施提供了一个较好的实验动物模型，然而国内此领域的研究仍然较少见。由于心肌炎发生发展的病理机制仍不清楚，治疗上仍然主要针对心肌炎的症状和并发症，比如充血性心力衰竭、心源性休克、传导异常、心律失常等等，而不是针对疾病本身。随着感染后免疫损伤机制研究的不断深入，使得免疫治疗在心肌炎的治疗中越来越受到重视，但是它们的有效性仍然存在争议。已有的研究表明EAM是T细胞介导的自身免疫性疾病，CD4⁺T细胞在疾病的发生和发展中起着最重要的作用，它们所产生的大部分细胞因子皆为激活免疫反应所必需。抗CD4单抗在体内可与CD4分子结合而干预CD4⁺T细胞的功能，诱导免疫耐受。基础和临床已经应用此抗体治疗某些自身免疫性疾病，但将此抗体用于治疗Lewis大鼠EAM的研究国内外仍未见报道。本研究首先提取并纯化猪心肌肌凝蛋白，应用自行提取得肌凝蛋白免疫Lewis大鼠，建立EAM模型，并深入地研究CD4⁺T细胞亚群与心功能及心肌纤维化之间的动态相关关系，以进一步阐明免疫损伤在心肌炎进展过程中的作用机制。并首次将抗CD4单抗作为一种免疫调节剂应用于Lewis大鼠EAM的防治。明确其是否能够诱导机体对心肌肌凝蛋白产生免疫耐受，以及通过免疫耐受的形成是否能够对EAM起到防治作用。以期更深入的了解自身免疫损伤在VMC发展成为DCM过程中的作用机制，为心肌炎及心肌病的治疗提供新的策略，同时也对其它自身免疫性疾病的治疗提供重要的理论依据。研究方法1．猪心肌肌凝蛋白的提取、纯化、鉴定及活性分析（1）利用不同浓度的钾离子溶液、超速离心、盐析等方法从猪心中获得心肌肌凝蛋白的粗提品；（2）利用离子交换层析对肌凝蛋白粗提品进行纯化；（3）Bradford测定蛋白质含量；（4）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）对蛋白质进行初步鉴定；（5）Fiske-Subbarow法测定蛋白质的活性；（6）质谱分析精确鉴定提取肌凝蛋白。2．EAM大鼠模型的建立及抗体干预Lewis大鼠104只，包括正常对照组、阴性对照组、免疫组、盐水治疗对照组、IgG治疗对照组、抗CD4单抗治疗组。分别于试验第0、7天给予免疫组、盐水治疗对照组、IgG治疗对照组及抗CD4单抗治疗组Lewis大鼠皮下注射含1mg心肌肌凝蛋白的乳浊液诱导EAM的产生。阴性对照组注射不含肌凝蛋白的等体积的乳浊液作为对照，分别于第-2，-1，0，1天注射4mg／kg的抗CD4单抗诱导免疫耐受的产生。IgG治疗对照组及盐水治疗对照组分别注射等量的IgG及盐水作为对照。3．试验观察与标本的采集接种前各组大鼠尾静脉取血，收集血清，接种后每天观察大鼠一般情况变化，接种后第18天，各组随机取8只行心脏超声检查。检查完毕后，下腔静脉取血，收集血清。取血后，处死大鼠，立刻无菌取出心脏及脾脏，将心脏称重，保存备用。脾脏立即行淋巴细胞增殖试验。接种后第30天及第49天，正常对照组、阴性对照组及免疫组均随机取8只鼠行心脏超声检查后，收集血清及心脏保存备用。4．指标检测（1）心脏超声检测大鼠心脏结构及心功能的变化；（2）心肌组织行H-E染色及Masson三联染色，光镜下观察炎症浸润及心肌纤维化改变，计算心肌病理积分；（3）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗心肌肌凝蛋白抗体滴度的改变；（4）淋巴细胞增殖试验体外观察淋巴细胞对于心肌肌凝蛋白的增殖反应；（5） ELISA检测血清Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2及Th2型细胞因子IL-6、IL-10水平的变化；（6）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测心肌组织Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2及Th2型细胞因子IL-4、IL-10水平的变化。研究结果1．本研究所获得的肌凝蛋白粗提品的产率为15mg／g（心肌湿重）。纯化后肌凝蛋白的产率为10mg／g。2．提取肌凝蛋白Ca²⁺-激活的ATP酶活性在纯化前为0.19Piμmol／（mg．min）纯化后为0.22Piμmol／（mg．min）。3．提取各阶段所得肌凝蛋白的纯度经过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测显示了随着提取的进行，肌凝蛋白不断的被从其它心肌蛋白中分离出来。粗提品在电泳图谱上基本显示3条带，分别相当于肌凝蛋白的重链和两组轻链。纯化后蛋白的电泳图谱与粗提品没有明显区别。4．纯化前蛋白质的A280／A260nm为0.52，而纯化后的A280／A260nm比值1.45，提示纯化后的肌凝蛋白核酸含量显著下降。5．加用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）对所获得的肌凝蛋白进行进一步鉴定显示：native-PAGE泳道显示在凝胶的顶端一条带，SDS-PAGE泳道显示为3条带，推测native-PAGE泳道内为非变性的肌凝蛋白，而SDS-PAGE泳道内为变性的肌凝蛋白。6．将标准肌凝蛋白作为Marker与提取蛋白同时进行电泳显示了提取蛋白与标准蛋白的条带基本相同。标准蛋白泳道内可见杂质条带，而提取蛋白泳道内未见杂质蛋白的出现。7．将native-PAGE泳道内的蛋白切下进行质谱分析，其肽指纹图谱经过数据库检索结果证实提取蛋白为心肌肌凝蛋白。8．EAM大鼠心脏超声改变：初次免疫后第18天，超声探及免疫组鼠大量心包积液，左室后壁及室间隔显著增厚，心腔缩小，心功能较正常对照组及阴性对照组显著降低，呈现急性期表现；初次免疫后30天免疫组鼠心包积液消失，室壁较18天变薄，但仍较正常对照组及阴性对照组厚，心功能呈现短暂的回升，呈现亚急性期表现；初次免疫后第49天，室壁厚度薄于正常及阴性对照组，心室腔扩大，心功能再一次显著地低于正常及阴性对照组，呈现慢性期扩张型心肌病的改变。9．EAM大鼠心肌病理改变：初次免疫后第18天，免疫组鼠全部出现典型的心肌炎改变，H-E染色见心肌组织出现广泛的炎细胞浸润，伴有心肌坏死：初次免疫后第30天，心肌及间质炎细胞浸润减少；第49天炎细胞浸润基本消失。Masson三联染色显示了大量心肌纤维化的存在。10．EAM大鼠血清抗心肌肌凝蛋白抗体改变：初次免疫后18天及30天，免疫组均检测到高滴度的抗体，而初次免疫后49天，抗体滴度却显著下降。11．EAM大鼠血清Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2及Th2型细胞因子IL-6、IL-10的改变：Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2在疾病的发病过程中均显著升高，以初次免疫后第18天最为显著，达到高峰，第30天和第49天逐渐降低；Th2型细胞因子IL-6、Il-10在初次免疫后第30天达到高峰，随后逐渐下降。12．EAM大鼠心肌Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2及Th2型细胞因子IL-4、IL-10mRNA表达的改变：Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2在疾病的发病过程中均显著升高，以初次免疫后第18天最为显著，达到高峰，随后逐渐下降；Th2型细胞因子IL-4、IL-10在初次免疫后18天已经显著升高，但在初次免疫后第30天达到高峰，随后逐渐下降。13．EAM大鼠细胞因子与心功能之间的相关关系：在初次免疫后18天和30天，LVFS与Th1型细胞因子之间存在显著的负相关关系，与Th2型细胞因子之间存在显著的正相关关系（P＜0.01）。然而，初次免疫后49天LVFS与血清Th1和Th2型细胞因子之间没有显著的相关关系（IFN-γ：r=-0.082，IL-2：r=-0.117，P＞0.05；IL-6：r=0.436，IL-10：r=-0.031，P＞0.05），与心肌Th1和Th2型细胞因子mRNA的表达之间也没有显著的相关关系（IFN-γ：r=0.456，IL-2：r=-0.459，P＞0.05；IL-6：r=0.229，IL-10：r=-0.008，P＞0.05）。初次免疫后49天Th1型细胞因子IFN-γ与心肌纤维化病理积分之间存在显著的负相关关系（r=-0.831，P＜0.05）；Th2型细胞因子与心肌纤维化病理积分之间存在显著的正相关关系（r=0.851，P＜0.01）；心肌细胞因子mRNA的表达与心肌纤维化病理积分之间也显示了类似的相关性。14．初次免疫后18天抗CD4单抗诱导免疫耐受的情况：（1）抗CD4单抗对于体外EAM大鼠淋巴细胞增殖反应的作用：抗CD4单抗治疗组脾细胞对猪心肌肌凝蛋白的增殖反应显著低于盐水治疗对照组及IgG治疗对照组；而应用非特异性丝裂原刀豆蛋白A进行刺激时，各组织间无显著差别。（2）抗CD4单抗对血清抗心肌肌凝蛋白抗体的作用：抗CD4单抗治疗组血清抗心肌肌凝蛋白抗体显著低于盐水治疗对照组及IgG治疗对照组。15．初次免疫后18天，抗CD4单抗对EAM的防治情况：（1）对EAM大鼠心脏结构和功能的干预：抗CD4单抗治疗组IVS和LVPW显著低于盐水治疗对照组及IgG治疗对照组，LVFS显著高于盐水治疗对照组及IgG治疗对照组。（2）对EAM大鼠心肌炎症及纤维化的防治：抗CD4单抗治疗组鼠肉眼积分显著轻于盐水治疗对照组及IgG治疗对照组。镜下观察，抗CD4单抗治疗组鼠心肌发现很少的炎细胞浸润及纤维化的存在，病理积分显著低于盐水治疗对照组及IgG治疗对照组大鼠。16．初次免疫后18天，抗CD4单抗对CD4⁺T细胞亚群分泌细胞因子的影响：抗CD4单抗的治疗显著降低了Th1型细胞因子的浓度，显著上调了Th2型细胞因子的浓度。研究结论1．本研究应用生化方法提取出了高纯度、高活性的心肌肌凝蛋白。2．本研究应用自行提取的猪心肌肌凝蛋白成功的诱导产生了EAM模型。3．EAM的病程进展呈现急性期、亚急性期、慢性期的改变。4．CD4⁺T细胞亚群Th1／Th2的失衡参与了疾病的发生发展，直接导致了急性期及亚急性期心功能紊乱和心室重构的发生。慢性期Th1／Th2型细胞因子可能通过干预纤维化的形成而对心功能的紊乱和心室重构起到重要的间接作用。5．抗CD4单抗成功的诱导了EAM大鼠对心肌肌凝蛋白产生免疫耐受。通过免疫耐受的诱导成功的阻止了EAM的发生。进一步证实了CD4⁺T细胞在EAM中的关键作用。6．抗CD4单抗干预了辅助性T细胞亚群Th1／Th2的平衡，使平衡向Th2方向发生极化，可能是免疫耐受形成的机制之一。创新及意义1．本研究对心肌肌凝蛋白的提取方法进行了改进，并加用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳及质谱分析对所提取蛋白质进行鉴定，避免了以往应用Western blot进行鉴定的缺点。提取产率高于以往的提取方法，为心肌肌凝蛋白下一步在临床和基础研究中的应用打下了坚实的基础。而且本文采用质谱分析技术不仅为其在医学领域的应用提供了线索，而且也为此技术在大分子蛋白质分析方面的应用提供了有利的证据。2．本研究利用自行提取的心肌肌凝蛋白成功的诱导了EAM的发生，并对EAM的发病过程进行了多角度多时间点的检测，将CD4⁺T细胞亚群分泌的细胞因子与心功能的动态变化进行相关分析，进一步揭示了自身免疫损伤导致心功能紊乱及左室重构的作用及其机制。3．本研究首次将抗CD4单抗应用于Lewis大鼠EAM的研究，成功地诱导了机体对心肌肌凝蛋白产生免疫耐受，阻止了EAM的发生发展。为人类VMC及DCM的治疗提供了重要启示。也为其他自身免疫性疾病的治疗提供了重要的理论依据。