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茅台镇是酱香型白酒的核心产区,长期的酒类酿造形成了独特的微生物生态结构。对酿造过程的细菌类资源开展研究,不仅仅可加深对酱香型白酒酿造发酵机理、机制等科学问题的认识,更是实现其优质高产酿造的前提。本课题应用高通量测序技术及其可培养分析方法对茅台镇酱香白酒酿造环境、大曲的细菌菌群结构、可培养菌群分布特征开展研究,并结合模拟发酵,对其可培养细菌特性开展详细的解析,进一步揭示茅台镇酱香白酒酿造细菌的资源分布特征及其发酵潜力,为其科学研究和产业发展提高科学理论、科技支撑。通过本课题研究,获得了如下主要结论:(1)利用高通量测序技术,从茅台镇酿造区域七个轮次环境样品中共检出细菌23个门,1-7轮次依次分别为:20、18、21、19、18、20和20个门,其中Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria为其优势细菌门;共检出其细菌549个属,1-7轮次依次分别为:445、397、408、435、431、451和400个属;从酿造生产用大曲样品中共检出细菌21个门,1-7轮次依次分别为:17、11、12、13、9、13和18个门,其中Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria为其优势细菌门;共检出细菌523个属,1-7轮次依次分别为:316、248、293、293、201、269和397个属。其中,Bacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus、Pantoea、Kroppenstedtia、Enterobacter、Staphylococcus、unclassified＿f＿＿Enterobacteriaceae、unclassified＿o＿＿Bacillales、Acetobacter、Sphingobacterium、Pseudomonas、Pediococcus和Lactobacillus为环境和大曲样品中的共有优势细菌属。(2)利用可培养结合分子鉴定技术,从茅台镇酱香型白酒1-7轮次的酿造环境及大曲中共分离检出细菌1370株,经形态、分子、同源性分析鉴定归属于5个门,28个属和59种细菌。其中,环境样品44个种,大曲样品34个种。其优势细菌门和优势细菌属与高通量测序结果具有高度一致性。其中,X1(Bacillus licheniformis)、X2(Bacillus sp.)、X3(Bacillus subtilis)、X4(Bacillus amyloliquefaciens)、X5(Bacillus subtilis subsp.subtilis)、X7(Bacillus tequilensis)、X9(Bacillus megaterium)、X12(Bacillus velezensis)、X17(Bacillus paralicheniformis)、X19(Lysinibacillus fusiformis)、X25(Staphylococcus sp.)、X26(Staphylococcus saprophyticus)、X32(Micrococcus sp.)、X54(Alcaligenes faecalis)、X57(Bacterium strain)和X58(Uncultured bacterium)为其环境和大曲样品中可培养检出的核心优势细菌种。(3)高通量测序技术及可培养结果表明,茅台镇酿造环境及生产用酱香大曲样品中的细菌菌群结构分为三类:1-2轮次聚为一类,3-5轮次聚为一类,6-7轮次聚为一类,与实际酿造生产的产酒质量具有显著性相关。(4)细菌耐受性研究结果表明:其最适生长温度为37~40℃,可耐受65℃的高温;最适生长p H值为5.0~5.5,可耐受p H值为3.0的酸性环境;最适生长葡萄浓度为5%,可耐受40%的葡萄浓度;较适宜生长乙醇浓度为4%vol,可耐受12%vol的乙醇浓度。菌株整体随温度的上升、酸度的增加及乙醇、糖浓度的升高其耐受性降低;X1(Bacillus licheniformis)、X2(Bacillus sp.)、X3(Bacillus subtilis)、X17(Bacillus paralicheniformis)和X58(Uncultured bacterium)具有高温耐受性特性;X1(Bacillus licheniformis)、X3(Bacillus subtilis)、X5(Bacillus subtilis subsp.subtilis)、X7(Bacillus tequilensis)、X17(Bacillus paralicheniformis)、X19(Lysinibacillus fusiformis)、X25(Staphylococcus sp.)和X26(Staphylococcus saprophyticus)具有高酸耐受性特性;X25(Staphylococcus sp.)和X26(Staphylococcus saprophyticus)具有高乙醇耐受性特性;X1(Bacillus licheniformis)、X2(Bacillus sp.)、X5(Bacillus subtilis subsp.subtilis)、X25(Staphylococcus sp.)和X58(Uncultured bacterium)具有高葡萄糖耐受性特性。整体而言,乙醇较温度、酸度和糖浓度对细菌的生长抑制性最明显。(5)模拟发酵结果表明:37℃发酵2 d后95%的菌株发酵产物感官呈香微弱,37℃发酵2 d再55℃发酵5 d后,96%的菌株发酵产物感官呈香明显,以呈现发酵香、焦糊香、酱香和粮香为主;X1(Bacillus licheniformis)、X2(Bacillus sp.)、X4(Bacillus amyloliquefaciens)、X5(Bacillus subtilis subsp.subtilis)、X7(Bacillus tequilensis)、X9(Bacillus megaterium)、X12(Bacillus velezensis)、X32(Micrococcus sp.)、X57(Bacterium strain)和X58(Uncultured bacterium)发酵产酱香明显;X2(Bacillus sp.)、X5(Bacillus subtilis subsp.subtilis)、X7(Bacillus tequilensis)、X17(Bacillus paralicheniformis)和X32(Micrococcus sp.)发酵呈花香、甜香和果香突出。(6)应用气质联用(GC-MS)对菌株发酵代谢产物检测,共检测出2339种挥发性化合物,其中主要化合物包括:醇类149种,酮类145种,酯类160种,酸类84种,硫化物52种,呋喃19种,吡嗪33种,含氮化合物537种,烷烃33种,芳香化合物303种,其他824种。优势菌株发酵共代谢主要风味化合物包括:醇类风味化合物62种,酮类66种,酯类75种,酸类35种,硫化物18种,呋喃3种,吡嗪17种,烷烃10种,芳香化合物102种。(7)结合高通量检出菌属丰度及可培养高频检出、发酵代谢组分数据分析,结果表明:Bacillus licheniformis、Bacillus sp.、Bacillus subtilis、Bacillus subtilis subsp.subtilis、Bacillus megaterium、Bacillus velezensis、Bacillus paralicheniformis、Lysinibacillus fusiformis、Staphylococcus sp.、Micrococcus sp.为茅台镇酱香白酒酿造生产用大曲的特征菌群结构,建议将其纳入大曲产品质量控制标准的微生物指标;Bacillus licheniformis、Bacillus sp.、Bacillus subtilis、Bacillus subtilis subsp.subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus tequilensis、Bacillus velezensis、Staphylococcus saprophyticus、Micrococcus sp.、Alcaligenes faecalis、Bacterium strain、Uncultured bacterium为茅台镇酿造环境的特征菌群结构,建议将其纳入酿造环境微生态监测及其评价指标。