对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是一种大型的杆状双链DNA病毒,具有双层囊膜,不能形成包涵体,隶属于线形病毒科(Nimaviridae)白斑病毒属(Whispovirus)。该病毒宿主范围很广,传染力强,致死率高,难防治,对虾、螯虾、蟹类等甲壳类都会被其侵染,这不仅严重危害对虾养殖,还会对海洋生态环境构成威胁。本文主要围绕病毒结构蛋白展开了功能研究,此外,还对病毒的核衣壳包装进行了初步的研究和鉴定。研究工作主要包括了以下几个方面:病毒wsv311基因的产物VP26是病毒的一个主要的囊膜蛋白,可能定位于病毒的膜与核衣壳之间。我们利用生物素标记转移方法证明VP26能够特异性地与核衣壳蛋白VP51发生相互作用。同样的方法反过来也可以证明标记过的VP51上的生物素信号可以特异性地转移到VP26蛋白上。随后利用Far-Westrn进一步证明了膜蛋白VP26与VP51的相互作用。我们认为VP26是一个起着“链接”作用的蛋白,在病毒中通过与VP51的相互作用将病毒的囊膜与核衣壳联系起来。在VP51能够与VP26相互作用的基础上,我们以构建好的重组载体pET-His-VP26为模板,设计引物分别扩增出含突变的VP26基因片段的重组载体。表达VP26的突变体蛋白并纯化,利用蛋白质相互作用的技术试图找到能够与VP51相互作用的VP26结合区域。体外合成VP26的长双链RNA并将其注射到感染病毒的对虾体内,在不同的时间用病毒检测试剂盒从病虾肌肉中提取病毒的基因组,通过荧光定量PCR(Real-time PCR)方法检测病毒拷贝数的变化来鉴定RNAi对病毒繁殖的影响。此外,我们高浓度病毒和dsRNA混合共注射至虾体内,在不同时间将的病虾肠胃取出,利用低温树脂包埋和切片技术,通过电镜观察病毒粒子的形态来鉴定RNAi对病毒包装的影响。病毒的核衣壳在高浓度的盐(≥0.3M)和TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mMEDTA,pH8.0)处理下会变得粘稠,电镜下观察到DNA纤维从病毒的一顶端释放出来。将高盐处理过的病毒核衣壳高速离心分上清和沉淀,SDS-PAGE证明上清中有可溶性的VP95蛋白的存在,而这部分的VP95蛋白是从病毒的核衣壳上洗脱下来的。VP95也是一个定位在病毒的膜与核衣壳之间的一个蛋白。通过RNAi实验沉默vp95基因,我们能观察到未包裹DNA的病毒粒子,充分说明VP95是病毒DNA包装进衣壳中的重要蛋白。我们推测VP95可能起着一个类似于塞子的作用,在病毒的包装中塞住核衣壳顶端开口防止DNA释放出来,当塞子蛋白被部分洗脱或构像发生变化时,DNA纤维就从病毒的顶端的通道释放出来。总之,我们对病毒的结构蛋白性质以及它们相互作用之间研究是了解病毒入侵、包装、成熟和释放的重要依据,将为防治病毒奠定科学基础。