论文部分内容阅读
自然界中,半纤维素是仅次于纤维素的第二大生物质能源,它的降解需要多种酶的协同作用,而木聚糖是半纤维素中的主要成分,本文主要研究一类阿拉伯木聚糖。木聚糖结合域(Xylan binding domain,XBD)作为一种非催化结构域,具有与木聚糖特异性识别和结合的功能,能与不同的木聚糖降解酶类紧密结合,从而增强与底物的可及度以便更好地发挥木聚糖降解酶的水解活性。本研究尝试通过基因重组技术将不同的木聚糖结合域分别融合到木聚糖降解酶基因上,构建具有特殊功能的重组酶,并对各重组酶相关生化性质进行研究,同时初步考察了重组木聚糖降解酶水解小麦阿拉伯木聚糖的效果。具体研究内容如下:1.选择了来源于粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)木聚糖酶(xylanase 11A)的木聚糖结合域XBD2b和来源于梭热杆菌(Clostridium thermocellum)木聚糖酶(CtXynGH30)中的木聚糖结合域XBD6与木聚糖酶基因融合获得融合基因,转化到宿主大肠杆菌中表达,结果重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-20b-xynA-XBD2b的产酶酶活(107 U/mL)和比酶活(48 U/mg)相比对照E.coli BL21pE3)/pET-20b-xynA(25U/mL 和 17.6 U/mg)分别提高 3.3 倍和 1.7倍。重组菌E.coli TOP10/pHsh-xynB-XBD2b的产酶酶活(0.52U/mL)和比酶活(0.21 U/mg)相比E.coli TOP10/pHsh-xynB(65.31 U/mL 和 28.4 U/mg)均显著降低了 99%。重组菌 BL21(DE3)/pET-28a-xynB-XBD2b 产酶酶活(7.79 U/mL)和比酶活(4.48 U/mg)相比 E.coli TOPl 0/pHsh-xynB 却明显下降了 88%和 84.2%。重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-xynB-XBD6 的产酶酶活(32 U/mL)和比酶活(12 U/mg)相比E.coli TOPl 0/pHsh-xynB的酶活(58 U/mL)和比酶活(23 U/mg)分别降低了 45%和49%,表明XBD2b的融合仅对E.coli BL21(DE3)/pET-20b-xynA-XBD2b的产酶酶活有提升作用。2.将XBD2b和XBD6与阿拉伯糖苷酶基因融合后获得融合基因,转化到大肠杆菌宿主进行表达,结果重组菌E.coli TOP 10/pHsh-Tm-ara-XBD2b的产酶酶活(2.26 U/mL)和比酶活(1.07 U/mg)相比 E.coli TOP10/pHsh-Tm-ara(4.52 U/mL和 2.1 U/mg)分别降低了 50%和 49%。重组菌E.coli TOP10/pHsh-BP-ara-XBD2b的产酶酶活(0.22 U/mL)和比酶活(0.12 U/mg)相比E.coli TOP10/pHsh-BP-ara(3.29U/mL 和 0.66 U/mg)分别降低了 93%和 82%。而重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-Tm-ara-XBD6的产酶酶活(6.8 U/mL)和比酶活(5.1 U/mg)相比未融合XBD6的重组菌(3.7 U/mL和2.5 U/mg)分别提高了 0.8倍和1.04倍,表明仅有XBD6的融合对重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-Tm-ara-XBD6的产酶酶活有一定的提升作用。3.分析重组木聚糖酶XynA-XBD2b和XynB-XBD6的最适反应条件及稳定性,并分别以未融合XBD的木聚糖酶XynA和XynB作为对照,结果表明重组酶XynA-XBD2b的最适pH,pH稳定性和温度稳定性相比XynA均未发生明显变化,重组酶XynA-XBD2b的最适反应温度降低了 5℃。重组酶XynB-XBD6的最适pH相比XynB降了 0.4个单位;最适反应温度降低了 5℃;pH大于6.2时,重组酶XynB-XBD6的pH稳定性略微下降;重组酶XynB-XBD6的温度稳定性相比XynB明显下降。4.对重组酶Tm-Ara-XBD2b和Tm-Ara-XBD6的最适反应条件及稳定性进行分析,以未融合XBD的阿拉伯糖苷酶Tm-Ara为对照。结果表明重组酶Tm-Ara-XBD2b的最适pH,最适反应温度,pH稳定性和温度稳定性相比Tm-Ara均未发生明显的变化。而重组酶Tm-Ara-XBD6的最适pH相比Tm-Ara降了 0.4个单位;最适反应温度不变;pH稳定性在而碱性条件下略微降低;重组酶Tm-Ara-XBD6的温度稳定性明显降低。5.通过评价融合XBD2b的木聚糖降解酶和单独的纯蛋白XBD6吸附不溶性阿拉伯木聚糖的性能,发现相比对照XynA和XynB,XynA-XBD2b和XynB-XBD2b对不溶性阿拉伯木聚糖均有一定的吸附能力,表明XBD2b对吸附不溶性木聚糖起到了至关重要的作用,且XBD6有吸附不溶性木聚糖的能力。6.利用重组酶XynA-XBD2b和Tm-Ara-XBD2b联合水解小麦麸皮阿拉伯木聚糖,结果重组酶XynA-XBD2b和Tm-Ara-XBD2b联合作用小麦麸皮阿拉伯木聚糖产生的还原糖含量高于XynA和Tm-Ara的联合作用,表明XBD2b起到了促进小麦麸皮阿拉伯木聚糖降解的作用,且随着侧枝酶Tm-Ara-XBD2b酶量的提高,水解小麦麸皮阿拉伯木聚糖产生的还原糖含量也逐渐增加,表明Tm-Ara-XBD2b在一定程度上起到了去除阿拉伯糖侧枝的空间位阻效应。而重组酶Tm-Ara-XBD6和XynB联合水解小麦麸皮阿拉伯木聚糖释放的还原糖含量高于重组酶Tm-Ara和XynB的联合作用,重组酶Tm-Ara-XBD6和XynA-XBD2b联合作用释放的还原糖含量高于Tm-Ara和XynA-XBD2b的联合作用,表明XBD6具有促进天然底物小麦麸皮阿拉伯木聚糖降解的作用。