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干扰素调节因子(Interferon Regulatory Factor,IRF)是一类参与机体内I型干扰素(IFN)及干扰素刺激基因(ISG)转录调控的调节因子。IRF在宿主细胞抵抗病毒侵入、调节细胞生长和免疫应答中都扮演着十分重要的角色。IRF-2是一种多功能的转录调控因子,在细胞凋亡、细胞周期调控过程中起重要作用。现有资料表明,IRF-2除了调控IFN基因、ISG基因转录外还具有启动其他细胞因子、趋化因子转录的功能。而且,在细胞免疫反应中他们能够同时扮演着不同的角色,如IRF-2除了作为干扰素系统基因的负调控因子外,还作为正调控因子激活白细胞介素-7基因、Ⅱ类转录活化子基因和Gig2基因的转录。为了解鱼类IRF-2作为负调控因子下调IFN、PKR、PKZ转录的分子机制。本文着重对实验室前期克隆的草鱼IRF-2(CiIRF-2)的功能进行了分析。系统发育树分析Ci IRF-2与鱼类IRF-2进化关系最为亲近,属于IRF-1亚家族。RT-PCR数据分析显示CiIRF-2在不同的组织中均能够表达,但表达量较低。经poly I:C刺激6-12 h后,除了脑组织外其他各检测组织表达量均明显上调。说明CiIRF-2参与了细胞的抗病毒免疫反应。实验室前期克隆的CiIFN启动子含有4个预测的IRF结合位点(IRF-E),分别从-67到-78、-107到-119、-456到-468和-646到-658。CiPKR和CiPKZ启动子各含有1个干扰素刺激应答元件(ISRE)分别是从-39到-51,-48到-58。为研究CiIRF-2与这些基因的启动子的亲和性,我们构建了含有草鱼IRF-2的ORF全长和nDBD结构域的原核表达载体,并通过镍柱亲和层析纯化目的蛋白。体外凝胶阻滞实验分析表明,原核表达纯化的Ci IRF-2与CiIFN,CiPKR,CiPKZ的启动子均有较强的亲和性。随后,构建了不同的启动子荧光素酶报告基因载体质粒(pGL3-IFN,pGL3-PKR,pGL3-PKZ)和真核表达载体质粒(pcDNA3.1-IRF-1,pcDNA3.1-IRF-2)分别共转染草鱼肾细胞(CIK cell),然后检测细胞荧光活性。实验结果表明:在CIK中,Ci IRF-2能够抑制CiIFN,CiPKR及CiPKZ的转录水平。为了进一步的了解Ci IRF-2抑制Ci IFN,CiPKR和CiPKZ转录的分子机理,我们先将pcDNA3.1-IRF-1和pcDNA3.1-IRF-2一起孵育,再与目的基因CiIFN,CiPKR,CiPKZ的启动子荧光素酶报告基因载体质粒分别进行瞬时共转染于CIK中。分析结果显示CiIRF-2是通过与CiIRF-1的相互竞争而对IFN及ISG基因的转录活性起到负调节作用。此外,共转染pcDNA3.1-IRF-3或pcDNA3.1-IRF-7和pcDNA3.1-IRF-2共同孵育,再与CiIFN的启动子荧光素酶报告基因载体质粒进行瞬时共转染于CIK中。结果表明Ci IRF-2与其它正调控因子(Ci IRF-3,Ci IRF-7)之间的相互作用同样可以消减细胞内IFN的转录活性。