烷基糖苷是一种“世界级”的“绿色”非离子表面活性剂。它具有表面张力小,起泡、分散、配伍性能好,去污能力优秀,无毒,对皮肤的刺激性小,可以被生物降解,可以由再生材料制得等诸多优点。普遍用于日化、农业、印染、纺织及石油等领域。目前工业上采用化学法来合成,但化学法存在一些缺陷,比如没有选择性,反应没有特异性,产物中会同时存在a和β异头物,反应过程需要高温高压,产品色泽较深。这不利于烷基糖的分离纯化,从而限制了其在食品药品领域的应用。与化学法相比,酶法合成具有选择性强、反应条件温和、过程简单等诸多优点。基于酵母细胞表面展示技术将木薯β-葡萄糖苷酶(MEBGL)展示在GS115细胞表面,制备成全细胞催化剂。这种固定化酶的方法非常简单、成本低,而且简单处理后就可回收再利用,克服了游离酶难以分离纯化和循环使用的缺点。全基因合成经过密码子优化的木薯β-葡萄糖苷酶基因mebgl,通过PCR进行扩增。以实验室原有质粒pKCALB-GCWn(n=12,19,21,51,61)为基础,构建重组质粒pKMEBGL-GCWn(n=12,19,21,51,61)。将构建成功的重组质粒经电转化转入毕赤酵母GS115。筛选出重组表面展示毕赤酵母GS115/pKMEBGL-GCWn(n=12,19,21,51,61)。将上述重组表面展示酵母以甲醇诱导产酶,采用以pNPG为底物的比色法测定水解酶活。测定的最适条件为,温度35℃;pH 6.0。GS115/pKMEBGL-GCWn(n=12,19,21,51,61)诱导168h后的最高水解酶活是0.56U/g(GCW21)。然后进行免疫荧光分析,荧光显微镜下可以观察到重组表面展示酵母发出的绿色荧光。相对于阴性对照菌,重组表面展示酵母菌的流式细胞仪峰图在X轴上存在着漂移。这都说明MEBGL已经成功展示在酵母表面。选用合成活力相对较高的GS115/pKMEBGL-GCW21进行合成烷基糖苷的研究。首先对其酶学性质进行评估。在底物浓度为10mM的情况下,对于pNPG,甲基-β-D-葡萄糖苷(MG),葡萄糖,纤维二糖和龙胆二糖五种底物来说。转化率最高的是pNPG,达到了52%。MG的转化率较低,仅为10%。该酶完全无法利用葡萄糖,纤维二糖,龙胆二糖合成烷基糖苷。以10mM的pNPG为底物,对于不同长度的受体脂肪醇来说,转化率随着碳链长度的增加而降低。正己醇的转化率最高,为70%。正辛醇的转化率比正己醇的稍低,为52%。十碳醇和十二碳醇,由于碳链过长,它们的转化率很低,分别为18%和2%。然后,对全细胞催化剂GS115/pKMEBGL-GCW21以pNPG和正辛醇为底物经转糖苷反应合成正辛基葡萄糖苷(OG)进行了研究。对于温度、pH值、酶粉添加量、含水量、底物浓度的单因素优化结果为,温度40℃,pH5.0,酶粉添加量0.05g,含水量50%,底物浓度30mM,转化率接近100%。然后,将底物浓度提高到50mM,70mM,含水量从35%到70%。底物浓度为50mM,含水量为50%时的转化率为74%。但随着底物浓度的进一步升高,转化率逐渐降低。当底物浓度为70mM时,转化率为37%。然后,进行三因素响应面实验。三个因素分别为酶粉添加量,含水量,底物添加量。使用Design-Expert.8.05b软件进行响应面实验的设计及数据拟合。利用拟合良好的模型预测并经实验证实的最适反应条件是酶添加量为0.05g,底物浓度为30mM,含水量为50%。