论文部分内容阅读
卵泡抑素(Follistatin，FS)具有广泛的生物学功能，特别是对动物的生殖活动和肌肉生长调节方面。关于FS生物学功能的研究，国内外已有相关的报道，但关于水牛FS(bFS)的研究却未见报道。本研究填补了这一空白，为阐明水牛的繁殖机制、提高水牛的繁殖性能奠定基础。目前由于国内外还没有bFS基因cDNA序列的克隆，本研究基于FS基因具有高度保守性的特点，根据GeneBank登录的奶牛的FS基因cDNA序列，设计了一对特异性的引物，并在引物两端加上相应的酶切位点和保护碱基，在起始密码加了ACC Kozak序列，为后续真核表达打下基础。抽提水牛卵巢组织总RNA，反转录合成cDNA第一链，cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得目的基因，将目的基因亚克隆到pMD-18载体，测序。测序结果在NCB1上进行Blast，显示本试验成功获得了bFS基因cDNA全序列，序列全长1035bp。同源性比较分析显示，本试验获得的bFS cDNA序列与奶牛、马、人和猪的同源性分别为98.8％、94.0％、91.7％、93.3％；与奶牛FS cDNA序列相比，有12处碱基发生了变化，其中+389位和+469位两处碱基的变化，造成氨基酸的改变。利用试验—获得的bFS cDNA序列，通过酶切-连接-转化-筛选-鉴定-测序等步骤，确认成功构建了真核表达载体pEGFP-bFS，全长5.7kb。用阳离子脂质体法，将pEGFP-bFS转入体外培养的水牛成纤维细胞和BHK细胞系，经过48h培养后，在相差荧光显微镜下观察质粒的表达情况，经RT-POR、Western-blot鉴定，证明本试验已成功在两种细胞中表达pEGFP-bFS融合蛋白。该试验为以后进一步研究bFS生物活性和制备工程疫苗提高水牛的繁殖性能和生长速度奠定基础。