胆管细胞癌是一种生长缓慢的消化道恶性肿瘤，恶性程度高，早期诊断率低，目前手术、化疗、放疗的疗效均不理想，预后较差。三氧化二砷（Arsenic trioxide,As₂O₃）是一种广泛存在于自然界的毒性化合物，在我国古代就用于治疗牛皮癣。梅毒等疾病，近年来As₂O₃已被成功应用于白血病的治疗。文献报道，As₂O₃对多种肿瘤细胞具有增殖抑制及促凋亡作用，但其对人胆管细胞癌的作用，国内外尚未见报道。 目的 本实验通过观察三氧化二砷在体外对人胆管癌细胞QBC939的生长抑制及诱导凋亡的作用，探讨其对人胆管癌细胞生长的影响及其抗癌机制。 方法 实验设空白对照组及实验组，体外培养的人胆管癌细胞QBC939经复苏后，接种于96孔板分组培养。实验组细胞用含不同浓度As₂O₃培养液培养，空白对照组用不加As₂O₃培养液培养。以下述方法检测：（1）台盼蓝染色：每日取出一组对照组及实验组细胞，台盼蓝染色后，于细胞计数板计数，1W后绘制细胞生长曲线。（2）MTT实验：实验组及对照组细胞分别于培养不同时间后终止实验，终止实验前4h每孔加入20μ1 MTT，细胞染色后以150μ1 DMSO溶解，酶联免疫仪检测（波长490nm）各孔的吸光值，计算细胞增殖抑制率。（3）细胞形态学观察：在培养状态下，用倒置显微镜观察培养瓶内实验组及对照组细胞形态变化情况。分别收集与不同浓度As₂O₃孵育72h的细胞及对照组细胞，洗涤，离心，40μmol·L^-1戊二醛4℃固定，透射电镜观察细胞超微结构特征。（4）流式细胞术测定：收集与不同药物浓度 第四军医大学硕士学位论文AS刃。共同孵育48h的细胞和对照组细胞，分别离心，PBS洗涤，调整细胞数约 10’个厅L，77 fnL·L”’乙醇 4℃固定，50 u g．ITl”‘PI染色，流式细胞仪检测DNA含量及细胞周期变化。（5）DNA Ladder的测定：常规消化收集、洗涤、裂解细胞，RNase作用，蛋白沉淀，将提取的DNA溶于TE缓冲液中，15 InL·L‘琼脂瞰胶电泳观察，照像。 结果门)台盼蓝染色：不同浓度的 AS。O。对人胆管癌细胞 QBC939均有明显抑制增殖作用，且量效时效关系明显，但大剂量主要导致细胞坏死：而以 4u mol·L”’的 As。O。抑制作用效果最明显。门)Mn实验：QBC939细胞经 4 113。e ASZO3作用后，增殖抑制率随作用时间延长而增加，96h的增殖抑制率达到 88．2％。 3)形态学观察：倒置显微镜下每日观察细胞形态变化，发现细胞由长梭形变为圆形或椭圆形，透射电镜观察到细胞凋亡特征：核边集、碎裂，凋亡小体产生。N)流式细胞仪测定结果：实验组出现凋亡峰，而对照组未见到：实验组细胞周期延长。6)＊＊A＊刎血r的测定：不同浓度的AS。O3作用时间不同，其出现梯状条带的时间也不同。随药物浓度的增加和作用时间的延长，其出现梯状条带的时间越早，条带越明显；而对照组未出现 DNA Laddr。 结论在一定浓度时，三氧化二砷在体外能有效地抑制QBC939细胞增殖，并诱导其凋亡，从而实现其抗癌作用。