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心力衰竭是各种心脏病的严重阶段,发病率和死亡率高,5年存活率和恶性肿瘤相仿。心力衰竭的治疗日益受到人们的关注。虽然药物治疗心力衰竭取得一定进展,但疗效有限,其它如心脏移植等外科治疗存在高风险,费用昂贵等缺陷,因此亟需寻找更为安全有效的治疗方法。在心力衰竭的治疗策略中,增加心肌细胞数目和纠正心肌细胞功能是治疗的两个主要方面。本研究以骨髓干细胞为平台,腺病毒为治疗基因载体,联合钙离子ATP酶基因(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,SERCa2a)和细胞移植治疗慢性充血性心力衰竭。比较单纯SERCA2a基因治疗,骨髓干细胞移植以及联合基因和细胞移植治疗心力衰竭的作用,探讨SERCA2a基因治疗,骨髓干细胞移植治疗心力衰竭的可能机制,评价以SERCA2a作为基因治疗靶点和骨髓干细胞作为平台应用于心力衰竭治疗的可行性。为寻找慢性心力衰竭尤其终末期心力衰竭的高效安全的治疗策略提供思路和实验基础。本研究分四个部分进行。 实验第一部分观察腺病毒载体转染骨髓干细胞(msenchymal stem cells,MSCs)的有效性和外源性基因表达的时相。体外培养大鼠(Sprague Dawley,SD)骨髓干细胞,用已构建好的Ad5-CMV-GFP真核载体分别转染培养的第3代(P3)及第8代(P8)MSCs。流式细胞仪检测转染后第2,4,7及10天绿色荧光蛋白(GFP)的表达率。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western杂交等方法检测腺病毒受体(CAR)在各代MSCs中的基因和蛋白质的表达。重组腺病毒对MSCs的转染率可达80%,P3与P8代MSCs转染率无明显差异(P>0.05)。转染后2天可见GFP表达,第7天表达水平达高峰,28天仍可见GFP在MSCs中表达。CAR在P1明显低于P2,P3,P6,P8各代MSCs(P<0.05),但P3,P6与P8 MSCs表达的CAR无显著差别(P>0.05)。重组腺病毒载体能有效转染骨髓干细胞,并维持1个月左右。P3与P8 MSCs均可作为基因治疗的高效细胞载体。 实验第二部分以腺病毒(Ad-CMV)介导SERCa2a基因转染MSCs,测定表达产物,为心力衰竭的细胞移植和基因治疗提供细胞水平的实验基础。体外