干细胞具有自我更新和特定条件下多向分化的特性,是研究生物发育和疾病的重要模型。大多数哺乳动物干细胞的染色体为二倍体结构,即细胞中有两套染色体,当一条染色体发生断裂或损坏,另一条染色体可以对其进行及时补偿。然而二倍体结构使两个等位基因同时发生突变形成隐性纯合体变得困难重重,不利于特殊基因的生物学遗传分析。另外,在遗传发育过程中,哺乳动物二倍体干细胞几乎不能独立发育为正常个体,究其原因在于起遗传发育和表观修饰与生殖细胞不同。而生殖细胞一个最重要的局限就是繁殖障碍。即使是通过多能干细胞或胚胎干细胞分化而来的单倍体细胞也是发育能力相对较差,不利于基因操作。而且小鼠孤雌生殖胚胎的卵圆柱期存在的部分单倍体细胞,随着胚胎的继续发育,大多数都转变为二倍体。因此,建立可用于遗传学分析的哺乳动物单倍体细胞系势在必行。2011年,Elling和Leeb两个研究小组分别开创性地报道了小鼠单倍体胚胎干细胞的建立,从此开启了关于多种细胞及发育过程基因的有效功能学筛选。哺乳动物单倍体胚胎干细胞（Haploid embryonic stem cells,h ES Cells）具有只含一套染色体、拥有体外无限增殖的特性,并可以形成多种功能细胞、组织和器官的干细胞类群,分为孤雌单倍体胚胎干细胞和孤雄单倍体胚胎干细胞两种。单倍体胚胎干细胞经过两年多的发展已成为研究基因遗传功能的理想工具并生产纯合突变转基因动物。然而,通过胞浆内注射孤雌单倍体胚胎干细胞产生转基因动物效率较低且由于表观异常而存活情况较差。因此,本研究目标是筛选出能够改善小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞产生效率和稳定性的最优培养体系,找出一种能够促进孤雌单倍体胚胎干细胞替代哺乳动物生殖细胞的体外试验性途径方法以改良卵母细胞生殖潜能和繁殖能力,并进一步探究孤雌单倍体胚胎干细胞自发二倍化和细胞自噬的内在机制。本研究主要结果如下:1.C57BL/6J小鼠孤雌单倍体干细胞系建立方法探究1.1C57BL/6J小鼠成熟卵母细胞激活条件和孤雌胚胎培养体系的条件优化激活未受精的卵母细胞形成孤雌胚胎是建立单倍体干细胞系的基础与关键。一般情况下,受精过程引发卵母细胞中钙离子的振荡,进而使其向胚胎发展,使用诸如氯化锶（Srcl2）或乙醇等替代物处理未受精卵母细胞可以完美复制该过程。为了制备孤雌单倍体胚胎,本研究首先通过18组不同外部激活方式和5组不同培养液的对比,筛选有利于形成单倍体孤雌囊胚的激活方法和培养体系。结果表明:选择注射h CG 16h的母鼠,取出成熟卵母细胞后,在含有10%乙醇培养液中激活卵母细胞10min的基础上,使用由M2培养液配制的5m M Srcl2激活剂处理2h有利于抑制第二极体的排出。选择M16培养液进行初期胚胎培养,可以获得更高的二细胞过阻滞率和桑葚胚/囊胚发育率的孤雌胚胎。最终我们获得186个单倍体孤雌胚胎及后续的87个孤雌孵化囊胚内细胞团。1.2小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞的建立及单倍体稳定性的追踪染色体二倍性通常是细胞正常发育所必需的,而单倍体胚胎干细胞在传代过程中也会自发的转变为二倍体核型。因此为了选择出获得小鼠单倍体卵裂球成功率较高及遗传性较稳定的方式,我们通过流式细胞荧光筛选和染色体核型追踪分析单倍体孤雌胚的培养体系,进而确定建立孤雌单倍体胚胎干细胞系的技术体系。结果显示:使用0.125%胰蛋白酶裂解孤雌单倍体囊胚为单个卵裂球并置于小鼠胎鼠成纤维细胞层（经丝裂霉素C处理后）上,经2i培养基（加有1μm PD0325901和3μm CHIR99021及1μm LIF因子的DMEM/F12培养液）培养4至7天可获得孤雌单倍体细胞克隆;每隔五代,将离散后的内细胞团进行Hoechst 33342染色,使用流式细胞仪分析孤雌胚胎细胞,将双倍体细胞和单倍体细胞区分开来;经20代以上的培养获得孤雌单倍体胚胎干细胞系13个（编号为:HAP1、HAP2……HAP13）;孤雌单倍体胚胎干细胞在筛选后初期世代维持较高的单倍体DNA含量以及单倍体染色体核型,细胞集落具有典型的胚胎干细胞形态特征,但是在末期世代（超过20代）出现二倍化或多倍化情况。2.小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞多能性的探究2.1小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞多能性分子水平验证本研究选取稳定遗传的HAP1孤雌单倍体胚胎干细胞系,选取第3代MEFs制备饲养层,将离散后的孤雌单倍体胚胎干细胞小团块移到饲养层上进行增殖培养,观察集落形态,并对细胞集落进行多能性鉴定。结果表明:小鼠孤雌单倍胚胎干细胞具有胚胎干细胞的典型特征,RT-PCR和Western blotting检测表明孤雌单倍体胚胎干细胞表达多能性基因Oct-4,Nanog和Sox-2;免疫荧光检测Oct-4和Nanog为阳性;在碱性磷酸酶（AP）表达方面,小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞AP染色呈现阳性,AP真实水平明显高于小鼠正常体细胞,与胚胎干细胞表达差异不显著,说明多能性程度较高。2.2小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞在体内和体外分化能力验证接下来,我们验证孤雌单倍体胚胎干细胞在体内和体外的分化能力。体外方面,我们检测孤雌单倍体胚胎干细胞在视黄酸（RA）的诱导下分化为神经细胞的能力;体内方面,我们移植孤雌单倍体胚胎干细胞集落到免疫缺陷小鼠皮下形成畸胎瘤并利用HE切片观察组织结构。结果表明:在100μM的RA处理下,小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞呈现神经样细胞状态并表达神经细胞标记因子Nestin;HE切片观察显示孤雌单倍体胚胎干细胞具有形成畸胎瘤的能力并且可以在体内分化为三个胚层来源的组织:腺体组织（内胚层）;脂肪组织和肌肉组织（中胚层）;神经组织和上皮组织（外胚层）。2.3小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞嵌合胚胎生殖潜能验证为了验证孤雌单倍体胚胎干细胞在小鼠遗传发育过程中的作用,我们将Actin-EGFP转基因小鼠（C57BL/6遗传背景）的成熟卵母细胞按照之前的方法培育成孤雌单倍体胚胎干细胞系。从61个EGFP阳性表达孤雌单倍体胚胎中筛选出一个稳定遗传的孤雌单倍体胚胎干细胞系（EGFP-ph ES cells）。我们利用流式细胞仪筛选出G0/G1期的EGFP-ph ES cells细胞集落并注射入昆明小鼠（毛色为白）囊胚中以期形成嵌合胚胎。体外培养12h后,将嵌合胚胎移植入假孕小鼠子宫。结果表明:小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞可以参与形成嵌合胚胎进而获得成活小鼠,在胚龄6.5天、10.5天、19.5天均表达EGFP,而且毛色嵌合也证实小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞具有参与胚胎发育及小鼠繁育的能力,但是小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞在胚胎发育过程中发生完全二倍化,失去单倍体性。3.Tet3在维持小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞生殖潜能方面的作用探究3.1小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞中Tet3表达谱分析在体外获得具有生殖潜能的生殖细胞是众多科学家研究的终极目标,目前的研究结果表明,小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞可以在补充父源基因组的前提下在去核卵母细胞内完成体外受精并发育为个体,但是效率很低且成活率极低。因此我们设想是否孤雌单倍体胚胎干细胞本身倍性的特殊和表观修饰（尤其是基因修饰）与正常卵母细胞不同才导致个体发育障碍,那么对孤雌单倍体胚胎干细胞做体外相关基因修饰是否可以具有更高繁育能力和后代存活率呢?RT-PCR检测孤雌单倍体胚胎干细胞中与发育和基因修饰相关的基因表达水平,结果显示将5甲基胞嘧啶（5mC）转变成5羟甲基胞嘧啶（5hmC）的DNA双加氧酶Tet3在其他基因RNA水平无显著差异的情况下,相对成熟卵母细胞在孤雌单倍体胚胎干细胞中出现明显下调;Western Bloting和免疫荧光都进一步验证孤雌单倍体胚胎干细胞中Tet3表达缺失;并且在视黄酸处理下出现神经样分化后,孤雌单倍体胚胎干细胞Tet3表达出现上调。综上说明相对卵母细胞和初期受精卵,孤雌单倍体胚胎干细胞在Tet3表达方面的缺失可能是造成其生殖潜能较弱的主要原因,可能通过调节5hmC水平参与母源基因组被动甲基化。3.2小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞Tet3过表达载体构建为了鉴定Tet3基因对小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞生长分化和生殖潜能的影响及其分子机制,本研究构建Tet3过表达载体并通过慢病毒转染系统提高其Tet3的表达,并进行细胞增殖检测和细胞分化检测。结果表明:通过免疫荧光和Western Bloting检测孤雌单倍体胚胎干细胞中Tet3表达上调后,细胞内5hmC水平出现增高趋势;Tet3过表达对其他发育基因影响不大,且对单倍体胚胎干细胞增殖能力和分化能力均无削弱作用。3.3过表达Tet3对小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞生殖潜能的影响为了验证Tet3过表达的小鼠孤雌胚胎干细胞是否具有卵母细胞正常的生殖潜能,我们通过去核卵母细胞（昆明小鼠遗传背景）内注射单个孤雌单倍体胚胎干细胞（C57BL/6遗传背景,2个HAP细胞系,1个EGFP细胞系）及成熟精子（昆明小鼠遗传背景）并体外激活的方法（ICPSI）组装重构胚胎。结果表明:免疫荧光显示孤雌单倍体胚胎干细胞重构胚胎表现出与正常单精子注射卵母细胞相似的甲基化模式;荧光显微镜观察不同胚龄的胎鼠均有EGFP表达;最终获得76个孤雌单倍体胚胎干细胞重构胚胎并自然分娩出11个胎鼠,其中2个存活下来并具有繁殖能力,近交后出现应有的毛色形状分离;胚胎发育过程中我们分析了雌性和雄性印记水平,均与正常胚胎无异。综上说明Tet3过表达在一定程度上提高了孤雌单倍体胚胎干细胞的生殖潜能及受精能力,支持胚胎继续发育,将遗传性状传递到下一代。4.小鼠孤雌单倍体干细胞自噬及二倍化机制的探究4.1小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞中SIRT1调节细胞自噬机制小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞在分化过程及多代培养后经常出现自发二倍化,而二倍体会后的单倍体胚胎干细胞具有更好的稳定性和发育能力。现在关于单倍体胚胎干细胞二倍化的机制研究几乎没有。为了寻找相关机制,我们利用1mM的H2O2产生衰老相关的活性氧（ROS）和增加氧分压来诱发单倍体胚胎干细胞发生相关自噬和凋亡。结果表明:小鼠孤雌单倍胚胎干细胞在经过1mM H2O2处理后发生不同程度的细胞自噬与凋亡,在细胞形态上与末期世代的小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞相似,并且均出现细胞二倍化和SIRT1表达水平上调;利用shRNA或烟酰胺（NAM）敲低或抑制SIRT1表达后,细胞自噬情况减弱且凋亡情况增强,且相关自噬蛋白均下调,自噬抑制相关mTOR通路相关蛋白均出现上调,说明SIRT1在小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞自噬中发挥作用。4.2小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞中SIRT1与P53相互调节机制我们通过RT-PCR和Western Bloting检测SIRT1敲低或抑制后,发现小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞中细胞凋亡、自噬相关基因P53的表达水平出现明显上调。为了进一步探究两者直接的联系,我们采用了免疫荧光和免疫共沉淀实验（CoIP）。结果发现在高氧分压的小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞中,SIRT1通过在细胞核中间接甲基化H3K9和在细胞质中直接去乙酰化P53从而抑制P53表达和细胞凋亡;相反,SIRT1敲低后,P53通过H3K9乙酰化而表达上调出现细胞凋亡增加。4.3小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞中SIRT1间接调控Tet3表达由于Tet3介导的相关DNA修饰与小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞分化和发育相关,我们进一步探究SIRT1敲低或抑制情况下Tet3表达情况。结果显示:West Bloting和RT-PCR实验显示Tet3在SIRT1敲低或抑制条件下出现明显下调且与其上游基因无关;免疫共沉淀实验（CoIP）则显示两者在H2O2处理下无直接结合作用;免疫荧光和West Bloting检测在SIRT1敲低和Tet3过表达两种情况下,SIRT1可以下调Tet3表达和H3K9me2表达,相反Tet3无法反作用影响SIRT1和H3K9me2表达,综上说明SIRT1通过甲基化H3K9来间接调节Tet3表达。4.4小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞中自发二倍体化机制探究通过流式细胞仪分析DNA含量,我们发现在SIRT1敲低的情况下,小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞的单倍体细胞数量有所增加,二倍化情况有所缓解;此外我们通过免疫组化实验发现,在体内发育为畸胎瘤后,发生二倍化的多世代小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞出现SIRT1高表达。综上说明SIRT1及其调节的细胞自噬可能参与小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞的自发二倍体化。总结论:小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞具有典型的胚胎干细胞特征,可以通过优化激活和培养方式来达到较高的获得率与单倍体稳定性;提高Tet3表达量有助于小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞生殖潜能维持;SIRT1在过氧化氢处理下,参与调节小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞的自噬并且间接抑制Tet3表达;小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞在传代末期发生一定程度的细胞自噬可能是导致其自发二倍化的原因。