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1目的观察肝豆灵联合重复经颅磁刺激对WD伴认知功能障碍的临床干预效果,研究肝豆灵对高铜负荷模型小鼠认知功能的影响及对神经干细胞保护的作用机制。为WD伴认知障碍的治疗提供新思路,为肝豆灵对高铜诱导的神经干细胞损伤小鼠的神经保护作用及其分子机制提供研究基础。2方法2.1临床研究根据纳入标准于2019年2月至2019年12月随机筛选就诊于安徽中医药大学第一附属医院脑病中心的86例具有认知功能障碍的WD患者,随机分组。病程、性别、文化程度、年龄,差异无统计学意义。对照组予以二巯基丙磺酸钠注射液治疗,肝豆灵组予以二巯基丙磺酸钠注射液联合中药复方肝豆灵治疗,rTMS组予以二巯基丙磺酸钠注射液、中药复方肝豆灵与rTMS治疗。利用MMSE量表和MoCA量表评价患者治疗前后的认知功能,进行前瞻性记忆测试,分别于治疗前后检验患者血清Hcy水平。比较三组MMSE、MoCA、TBPM、EBPM量表评分的变化及血清Hcy水平的差异。2.2实验研究将73只SD大鼠随机分为对照组,高铜模型组,肝豆灵高、中、低剂量处理组。用药剂量按照体表面积换算法,根据70kg成人每日使用剂量换算得出。肝豆灵每0.3g溶于8ml溶液,低剂量组给药剂量为0.48g/kg/d,中剂量组为0.96g/kg/d,高剂量组为1.92g/kg/d。对照组、模型组予以等体积生理盐水灌胃。7天后利用T臂迷宫观察大鼠空间学习记忆能力的变化。取孕14d ICR小鼠海马组织,分为对照组、模型组和肝豆灵处理高、中、低剂量组。对照组加入10%的SD大鼠空白血清,模型组利用含10%的SD大鼠空白血清铜负荷培养基培养,肝豆灵低、中、高剂量组予以3种不同剂量配制的10%的肝豆灵药物血清铜负荷培养基培养,利用流氏细胞仪检测神经干细胞ROS水平。3结果3.1临床研究3.1.1三组MoCA及MMSE总分比较对照组治疗前后MoCA及MMSE总分变化差异无统计学意义(P>0.05)。肝豆灵组、rTMS组与治疗前比较,MoCA总分提高,差异有统计学意义(P<0.01)。肝豆灵组与对照组治疗后比较,MoCA总分提高,差异有统计学意义(P<0.05);rTMS组MoCA总分提高,差异有统计学意义(P<0.01);rTMS组与肝豆灵组比较,MoCA总分提高,差异无统计学意义(P>0.05)。MMSE评分各组间变化差异无统计学意义(P>0.05)。提示肝豆灵可提高WD伴认知功能障碍患者的认知水平,联合rTMS效果更佳。3.1.2 MoCA量表中空间与执行评分、记忆评分比较MoCA量表中空间与执行评分比较。肝豆灵组、rTMS组与治疗前比较,分值提高,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组治疗后比较,肝豆灵组分值提高,差异无统计学意义(P>0.05),rTMS组分值提高,差异有统计学意义(P<0.05)。rTMS组与肝豆灵组比较,分值提高,差异无统计学意义(P>0.05)。MoCA量表中记忆评分比较。肝豆灵组、rTMS组与治疗前比较,分值提高,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后与对照组比较,肝豆灵组分值提高,差异无统计学意义(P>0.05);rTMS组分值提高,差异有统计学意义(P<0.05);rTMS组与肝豆灵组比较,分值提高,差异无统计学意义(P>0.05)。提示肝豆灵可改善WD伴认知功能障碍患者的空间与执行、记忆水平,联合rTMS效果更佳。3.1.3三组EBPM、TBPM评分比较三组EBPM评分比较。肝豆灵组、rTMS组与治疗前比较,分值提高,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组治疗后比较,肝豆灵组分值提高,差异无统计学意义(P>0.05);rTMS组分值提高,差异有统计学意义(P<0.01)。rTMS组与肝豆灵组比较,分值提高,差异有统计学意义(P<0.05)。三组TBPM评分比较。肝豆灵组、rTMS组与治疗前比较,分值提高,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组治疗后比较,肝豆灵组分值提高,差异无统计学意义(P>0.05);rTMS组分值提高,差异有统计学意义(P<0.05);rTMS组与肝豆灵组比较,分值提高,差异无统计学意义(P>0.05)。提示肝豆灵可提高WD伴认知功能障碍患者的前瞻性记忆水平,联合rTMS效果更佳。3.1.4三组血清Hcy水平比较对照组与治疗前比较,Hcy水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);肝豆灵组、rTMS组与治疗前比较,Hcy水平降低,差异有统计学意义(P<0.01)。肝豆灵组、rTMS组与治疗后对照组比较,Hcy水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);rTMS组与肝豆灵组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。提示肝豆灵可有效降低WD患者血清Hcy水平。3.2实验研究3.2.1行为学结果造模前,各组进入电刺激区的时间(S)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。模型组、低剂量组、中剂量组与造模前比较,进入电刺激区的时间延长,差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组比较,模型组、低剂量组、中剂量组进入电刺激区的时间延长,差异有统计学意义(P<0.01)。中剂量组与模型组比较,进入电刺激区的时间减少,差异有统计学意义(P<0.05)。高剂量组与模型组比较,进入电刺激区的时间减少,差异有统计学意义(P<0.01)。提示高铜负荷大鼠存在明显空间学习记忆障碍,经中、高剂量肝豆灵治疗后,大鼠空间学习记忆能力得到改善。3.2.2 ROS检测结果模型组、低剂量组、中剂量组与对照组比较,ROS水平增高,差异有统计学意义(P<0.01)。高剂量组与模型组比较,ROS水平下降,差异有统计学意义(P<0.05)。说明高铜负荷可导致小鼠NSC中ROS水平增高,而肝豆灵对模型造成的损伤有一定的修复作用。4.结论4.1中药复方肝豆灵能改善WD伴认知功能障碍患者的认知水平,尤其空间执行与记忆方面,肝豆灵联合rTMS治疗效果更佳。4.2肝豆灵可降低WD患者血清Hcy的水平。4.3肝豆灵可降低小鼠神经干细胞中ROS水平,改善高铜负荷大鼠空间学习记忆能力。