论文部分内容阅读
目的:1、探讨骨关节炎炎性环境下铁稳态的变化及铁过载对骨关节炎的影响2、探讨铁离子依赖的氧化应激损伤在铁过载致骨关节炎中的作用及机制3、研究小分子淫羊藿苷对铁过载的保护作用及机制,探讨中药提取物在治疗铁过载中的应用方法:1、提取原代小鼠软骨细胞体外培养,促炎因子IL-1β或TNF-α干预后检测铁离子内流和外流的改变,然后进一步检测调控铁离子流相关蛋白的改变。取10周龄C57/BL6雄性小鼠通过手术诱导膝关节内侧半月板不稳定建立小鼠DMM骨性关节炎模型,左腿给与假手术操作做为对照,检测转铁蛋白结合受体TFR1和膜铁转运蛋白FPN的表达,动物实验验证骨关节炎关节软骨细胞铁稳态的调控变化。最后通过铁过载细胞模型检测铁过载对软骨细胞的影响。2、不同浓度的枸橼酸铁铵(FAC)干预软骨细胞,检测软骨细胞活性氧ROS水平和线粒体膜电位的变化,然后抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)干预检测铁过载诱导的氧化应激和线粒体功能破坏在铁过载导致的骨关节炎病理进展中的作用。然后Western Blot检测线粒体分裂相关蛋白MFF/DRP1的表达。3、取10周龄C57雄性小鼠采用腹腔注射右旋糖酐铁(500mg/kg)每周一次,构建小鼠铁过载模型,淫羊藿苷灌胃干预,2个月后通过Micro-CT对股骨进行定量分析,ELISA检测骨转化指标TRAP、CTX-1、ALP和OCN的血清水平。使用MC3T3-E1成骨细胞系来验证淫羊藿苷对铁过载导致的成骨抑制的保护作用,进一步通过检测活性氧ROS水平和线粒体功能来研究淫羊藿苷治疗铁过载的作用机制。结果:1、通过体外实验我们发现IL-1β或TNF-α可促进铁离子内流调控蛋白转铁蛋白结合受体1(TFR1)和二价金属转运蛋白(DMT1)的表达,抑制膜铁转运蛋白(FPN)的表达,从而促进铁离子内流,抑制铁离子外流,造成细胞铁过载。动物实验也证实了骨关节炎关节软骨TFR1表达升高,FPN表达降低。枸橼酸铁铵(FAC)干预软骨细胞模拟细胞铁过载,发现软骨细胞关节炎相关蛋白表达升高,而铁螯合剂干预阻断铁离子流后关节炎相关蛋白表达降低。2、FAC干预软骨细胞可促进软骨细胞活性氧的产生和线粒体膜电位的降低,同时Western Blot结果提示线粒体分裂蛋白表达升高,而抗氧化剂NAC干预后不仅可逆转FAC对线粒体功能的破坏,而且可抑制FAC诱导的软骨细胞凋亡和骨关节炎相关蛋白表达的升高。3、铁过载可导致小鼠骨质疏松,而淫羊藿苷灌胃干预后骨密度明显升高。铁过载可导致MC3T3-E1成骨细胞活性氧的升高和线粒体膜电位的降低,淫羊藿苷干预明显逆转了这一趋势。淫羊藿苷干预还可明显减低小鼠骨髓腔内铁色素的沉积。结论:1、我们的研究表明骨关节炎炎性环境下促炎因子可通过上调TFR1和DMT1的表达促进铁离子内流,下调FPN的表达抑制铁离子外流,从而造成软骨细胞铁过载。铁过载可促进骨性关节炎的发生和发展。2、我们的研究结果表明铁过载通过氧化应激和线粒体功能的破坏,导致软骨细胞的凋亡增加及基质金属蛋白酶MMPs的表达。3、我们的研究结果还表明淫羊藿苷可用于治疗铁过载导致的相关疾病。