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本课利用实验室保藏的壳聚糖酶产生菌-烟曲霉CK(Aspergillus fumigatus CK)作为出发菌株,对菌种选育、发酵条件优化和酶解条件进行了深入地研究,方案和结果如下:
首先利用紫外线和60Co对烟曲霉进行复合诱变处理并进行抗分解代谢物筛选,以壳聚糖作为唯一氮源,葡萄糖作为碳源,同时葡萄糖作为抗分解代谢阻遏物,选育获得一株抗分解代谢阻遏的高产突变株UC-19。起始菌株壳聚糖酶活是5.3U/mL,突变株UC-19壳聚糖酶活达到14.6U/mL,比起始菌株提高了175%。
然后运用响应面分析对烟曲霉产酶条件进行优化,首先采用部分因子实验筛选出影响壳聚糖酶产量的显著因子牛肉膏和CaCl2;然后利用最陡爬坡路径逼近最大产酶区域。
最后应用中心组合设计和响应面分析确定突变株UC-19产壳聚糖酶的最佳培养基组成。经过优化,其最佳培养基组成为(%,w/v):壳聚糖1.5、牛肉膏2.1、KH2PO4 0.1、MgSO4·7H2O 0.1、CaCl2 0.4、tween-80 0.1,pH 5.5~6.0在此条件下发酵液中壳聚糖酶活可达44.24U/mL,比优化前酶活(13.01 U/mL)提高了225%。
利用所产的壳聚糖酶进行壳寡糖的生产,壳聚糖酶活约为18U/mL,壳聚糖和酶液的量比为1:3(g/v),分别在60℃、65℃和70℃水浴下水解,研究了水解过程中还原糖量和A420色度值随着水解时间的变化情况,得出最佳的水解条件为温度为60℃,时间为100min,此时还原糖量/A420色度值最大,达到79.03。水解后,在温度60℃和活性炭用量2.5%(g/v)下脱色35min,脱色后的酶解液经过喷雾干燥,做成固体壳寡糖,经过对其平均聚合度和分子量的测量,壳寡糖的平均聚合度为3,平均分子量为500。