研究背景:糖代谢紊乱和脂代谢紊乱往往共同存在,并且相互影响。高脂血症的患者可引起影响血糖的多个脏器功能的紊乱。血脂过高引起肝脏功能异常,导致肝脏糖异生及糖原合成和分解过程的紊乱;高胆固醇血症可加剧胰岛beta细胞的损伤,进一步加重糖尿病患者的病情。同时,血糖水平的异常也会加重脂代谢的紊乱。血糖高于正常值的患者及2型糖尿病患者存在胆固醇转化及合成过程的异常。而糖尿病患者血糖的控制情况同样影响其血脂的控制,并且糖尿病患者糖化血红蛋白水平与血脂水平呈正相关。CRTC2是重要的调节糖代谢的因子,在空腹时可通过促进肝脏的糖异生水平增加血糖;而进食后可降低肝脏糖异生的效率,减少血糖,从而维持正常的血糖水平。但是近年的文献报道,在CRTC2敲除的小鼠中存在血甘油三酯水平的下降。并且在3T3L1细胞中稳定表达shRNA CRTC2后,细胞中甘油三酯的水平也明显降低。这些数据提示我们CRTC2是否除了调节糖代谢外还参与了脂代谢的调控?FoxOs是转录因子forkhead家族的一员,主要通过特异性的识别基因启动子区上IRE(insulin response element,IRE)序列调节下游目的基因的表达。在哺乳动物体内,FoxOs家族有四个主要成员:FoxO1,Fox03,Fox04和FoxO6,他们作为重要的转录因子调节了多种细胞信号通路:如能量代谢通路,应激及寿命。FoxOs在CRTC2存在时主要以磷酸化的形式存在于细胞浆中。当受到刺激后可脱磷酸化被激活并且进入到细胞核内激活目的基因。另外,FoxOs的乙酰化修饰也可以调节其转录活性。作为FoxOs家族的一员,FoxO1主要调节肝脏的糖异生水平。FoxO1可以通过识别糖异生的关键酶PEPCK和G6P启动子区IRE序列,调节肝脏糖异生的能力。近年研究发现:FoxO1不仅能调节糖代谢的相关基因,还可以调节脂代谢的相关因子。小鼠肝脏长期敲除FoxO1后,肝脏糖生成水平明显下降的同时,血液中胆固醇、游离脂肪酸及VLDL的表达明显增加。此外,FoxO1可特异性识别SREBP-2启动子区上的IRE序列,负性调控SREBP-2的转录水平。这说明,糖代谢的调节因子可能也同时调节了脂代谢,为我们研究糖脂代谢共存的分子机制提供了可能性。SREBP-2作为重要的调节胆固醇合成的因子。SREBP-2以前体的形式在内质网上合成,进入到高尔基体后剪切成为具有转录活性的活性体形式。在细胞核中,成熟的SREBP-2控制了涉及到多种胆固醇代谢的因子的转录,包括胆固醇从头合成的限速酶HMGCR。SREBP-2的调控涉及到转录及转录后的修饰过程。SREBP-2的转录调控可通过其活性形式对其启动子区SER序列的前反馈来实现,也可通过FoxO1对其启动子区IRE序列的调控来完成。SREBP-2转录后的修饰包括裂解为活性形式的过程及乙酰化及甲基化的修饰等。本课题通过体内外实验证实了 CRTC2的确能促进肝脏中胆固醇的生成,并进一步探讨了 CRTC2至少部分通过FoxO1调节SREBP-2的转录水平,进而影响胆固醇合成的限速酶HMGCR的分子机制。目的:1、明确在高胆固醇血症患者及糖脂代谢紊乱共存的高脂小鼠模型中CRTC2及胆固醇合成相关因子的表达增加。2、通过尾静脉注射过表达CRTC2腺病毒的小鼠模型及CRTC2敲除的小鼠模型,证实CRTC2对血液及肝脏脂质的影响,尤其对肝脏新生胆固醇的调节作用。3、通过体内外实验证实CRTC2对肝脏中HMGCR的上调作用。4、通过尾静脉注射过表达的CRTC2及SREBP-2干扰病毒的小鼠模型和细胞实验,验证CRTC2通过SREBP-2上调肝脏中HMGCR的表达。5、证实CRTC2可减少细胞核内FoxO1的表达,进一步验证CRTC2对SREBP-2转录水平的调节通过FoxO1来实现。研究方法:1、人肝脏标本的获得:山东省立医院进行肝血管瘤手术患者的肝脏标本。2、细胞培养:HEK293细胞,CHO细胞,BNL细胞及HepG2细胞根据ATCC细胞培养标准进行培养。3、动物模型:(1)建立高胆固醇小鼠模型:雄性C57BL/6J小鼠(6周-8周)高胆固醇饮食(HC-diet)及普通饮食(Chow-diet)喂养。(2)过表达CRTC2及干扰SREBP-2病毒的小鼠模型:采用尾静脉注射病毒的方式给与C57BL/6J雄性小鼠同时注射过表达CRTC2的腺病毒及干扰SREBP-2的慢病毒。(3)CRTC2-KO小鼠:在SPF环境饲养并采用杂合子繁殖同窝对照的野生型(CRTC2+/+,Wt)及敲除型(CRTC2-/-,KO)小鼠,经鉴定后待雄性小鼠7周左右给与高胆固醇饮食(HC-diet)喂养18周或含有不同浓度胆固饮食喂养3天(0.02%,1%,4%胆固醇饮食)。(4)CRTC2敲除小鼠高胆固醇饮食14周后,尾静脉注射过表达CRTC2的腺病毒。(5)注射过表达荧光素酶病毒的小鼠模型过表达腺病毒CRTC2及HMGCR-Luciferase小鼠模型:采用尾静脉注射病毒的方式给与C57BL/6J雄性小鼠注射过表达CRTC2和阴性对照病毒的小鼠并同时注射Ad-HMGCR-Luciferase病毒。注射SREBP-2-Luciferase小鼠模型:雄性CRTC2敲除小鼠(CRTC2-/-及CRTC2+/+)给与高胆固醇饮食18周后,尾静脉注射腺病毒介导的SREBP-2-Luciferase。4、采用Realtime-PCR检测各因子基因水平的表达:检测CRTC2、HMGCR、FDPS、SS、SREBP-2、LDLR、PEPCK、G6P、FAS、SREBP-1C、ABCA1、ACAT2、CYP7A1、FoxO1在小鼠肝脏及细胞内的表达变化。5、采用 Western Blotting 检测 CRTC2、HMGCR、SREBP-2、PEPCK、CREB、p-CREB、FoxO1 及 Lamb 和 β-actin 蛋白水平的变化。6、采用免疫荧光法检测HMGCR在细胞内的表达,H&E染色了解小鼠肝脏脂肪变情况。7、CRTC2及FoxO1基因沉默:采用脂质体法以CRTC2及FoxO1特异性siRNA转染HepG2细胞,以沉默CRTC2和FoxO1的表达。8、血脂、血糖及肝功测定检测指标:血脂(总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇)及血糖和ALT、AST,采用Mindrary全自动生化分析仪(山东省立医院内分泌实验室)检测。9、肝细胞内及肝脏中总胆固醇(TTC)、游离胆固醇(FTC)的检测:采用检测试剂盒(北京普利莱公司),实验操作按照说明书进行定量测定。10、肝细胞内胆固醇染色(Filipin):采用Filipin染色试剂盒(GENMED),实验操作按照说明书进行定量测定。11、荧光素酶活性分析检测指标:含有CRE及SRE结合位点及突变位点的HMGCR启动子区域重组质粒荧光素酶活性分析以及含有half-site CRE、IRE-1、IRE-2位点及突变位点的SREBP-2启动子区域重组质粒荧光素酶活性分析。12、小动物活体成像:采用小动物活体成像仪检测CRTC2对小鼠肝脏中HMGCR启动子区及SREBP-2启动子区的影响。13、糖耐量试验检测小鼠糖代谢紊乱。14、小鼠肝脏新生胆固醇的检测:根据相关文献检测CRTC2对肝脏中新生胆固醇的调节。15、CHIP分析CRTC2对FoxO1与SREBP-2启动子区结合的影响。结果:1、CRTC2在高胆固醇血症患者肝脏中的表达增加高胆固醇血症患者血低密度脂蛋白(LDL-C)较血脂正常组患者增加明显(P<0.01);而血甘油三酯(TG)及高密度脂蛋白(HDL-C)有增高的趋势,但无统计学差异;肝脏中游离胆固醇(FTC)及总胆固醇(TTC)的含量在高胆固醇血症患者中也有显著增加,但是肝脏中TG的含量没有统计学差异;Real-time PCR结果显示高胆固醇血证患者肝脏中CRTC2、SREBP-2、HMGCR的表达较正常组明显增加;但是SREBP-1a、LXR、FoxO1、HMGCS及LDLR的表达与正常组比较没有明显差异。2、CRTC2在高胆固醇小鼠模型肝脏中的表达增加雄性C57BL/6J小鼠高胆固醇饮食20周后,体重与正常对照组饮食小鼠比较没有明显差异,而肝体比,空腹血糖和血脂水平明显增加;肝脏中脂滴及FTC及TTC水平也增加明显;同时,肝脏中基因及蛋白水平的CRTC2及PEPCK的表达也有明显增加(P<0.01)。3、CRTC2过表达和敲除对血脂、肝脂,尤其是肝脏新生胆固醇的影响小鼠通过尾静脉注射过表达的CRTC2腺病毒后,和对照组小鼠比较:体重,肝体比及空腹血糖水平增加,糖耐量试验也存在异常;同时,血脂及肝脏中脂滴及FTC的水平也增加明显。HepG2细胞过表达CRTC2后TC水平也有明显增加;而CRTC2敲除小鼠(CRTC2-/-)给与高胆固醇喂养后18周后,与野生型(CRTC2+/+)相比空腹血糖水平及糖耐量水平明显降低。血脂水平减少的同时,肝脏体积也显著减少;H&E染色显示:CRTC2-/-小鼠肝脏中脂质聚集减少,而肝脏中FTC的含量和CRTC2+/+小鼠比也有明显减少;但是,我们给与CRTC2-/-小鼠注射过表达的CRTC2病毒后,肝脏中FTC水平较注射对照组病毒明显增加。同时,我们观察到过表达CRTC2小鼠肝脏中新生胆固醇水平与对照组比有明显增加(P<0.01)。4、体内外实验证实CRTC2对肝脏中HMGCR的上调作用检测过表达CRTC2的小鼠肝脏基因水平发现:HMGCR,FDPS,SS,ABCA1及PEPCK在过表达小鼠组中明显增加,而ACAT2则减少明显;同时检测到过表达CRTC2的HepG2细胞中CRTC2,HMGCR,PEPCK和G6P的表达明显增加;小动物活体成像结果显示:过表达CRTC2后小鼠HMGCR荧光素酶的活性和对照组比较增加明显。而在CRTC2敲除小鼠中发现基因水平的HMGCR,HMGCS,SS,LDLR,ABCA1,ACAT2 及 PEPCK 的基因水平有显著减少;蛋白水平的结果显示:过表达CRTC2小鼠肝脏中CRTC2增加的同时,HMGCR及PEPCK的表达也有显著增加;相反,CRTC2敲除小鼠肝脏中蛋白水平的CRTC2及HMGCR、PEPCK的表达明显降低;而干扰掉CRTC2后,免疫荧光检测到HepG2细胞中HMGCR的表达明显降低。5、CRTC2通过SREBP-2上调肝脏中HMGCR的表达荧光素酶报告基因检测结果显示HMGCR-Luciferase分别突变SRE及CRE位点后,CRTC2引起的HMGCR的转录效应降低;过表达CRTC2的小鼠肝脏中SREBP-2基因及蛋白水平(前体及成熟体)的增加明显;HepG2细胞中过表达CRTC2后与动物实验的结果类似。而HepG2细胞转染外源性的Flag-SREBP-2质粒后,CRTC2呈剂量依赖性的增加外源性的SREBP-2前体及成熟体的增加。相反,CRTC2敲除后,小鼠肝脏中SREBP-2的基因及蛋白水平(前体及成熟体)的表达均下降。给与过表达CRTC2病毒引起的小鼠肝脏中SREBP-2蛋白及基因水平增加的同时再给与SREBP-2 siRNA干扰病毒注射后,SREBP-2的表达明显减少。6、CRTC2通过减少FoxO1的入核,上调SREBP-2的转录水平CRTC2敲除及野生型小鼠尾静脉注射SREBP-2-luciferase病毒后进行活体成像,结果显示:CRTC2敲除小鼠SREBP-2-luciferase的活性与野生型比较明显降低;CHIP结果显示:CRTC2过表达的细胞中,FoxO1与SREBP-2启动子区的结合明显减少。同时,我们观察到:转录抑制剂-放线菌素D(actinomycin D)可明显抑制HepG2细胞内CRTC2及SREBP-2在基因水平的表达;同时给与过表达的CRTC2及放线菌素D后,CRTC2引起的SREBP-2的表达也被抑制。SREBP-2-luciferase启动子区上突变CRE位点后,CRTC2对其激活作用减弱,但未完全阻断;同时我们观察到HepG2细胞进行FoxO1干扰后,基因水平的SREBP-2表达明显增加。CRTC2敲除小鼠肝脏中基因水平的FoxO1表达无明显变化,但是核蛋白水平的FoxO1表达明显增加。在BNL及HepG2细胞中过表达CRTC2后,基因水平的FoxO表达无明显变化,但蛋白水平的FoxO1表达明显减少。荧光素酶检测CRTC2对SREBP-2启动子区FoxO1的特异识别序列 IRE 发现:在 SREBP-2-luciferase 突变 IRE1 位点后,CRTC2 对 SREBP-2转录水平的调节作用明显增加,而突变IRE2位点后,没有明显的改变。7、CRTC2在不同浓度胆固醇饮食的小鼠模型中调节SREBP-2的活性CRTC2敲除的小鼠给与不同浓度胆固醇饮食喂养3天后,肝脏成熟体水平的SREBP-2随着胆固醇浓度的增加而降低。同时,基因水平SREBP-2、HMGCR、HMGCS和LDLR也随着胆固醇浓度的增加而减少;但是肝脏中TTC及FTC的含量随着胆固醇浓度的增加而增加。结论:1、高胆固醇血症患者及高胆固醇模型小鼠肝脏中CRTC2的表达明显增加。2、CRTC2的确能影响肝脏脂质水平尤其是肝脏新生的胆固醇的水平,并且对新生胆固醇的调节可通过HMGCR来实现。3、CRTC2通过SREBP-2调节HMGCR的表达进而影响肝脏胆固醇的合成。4、CRTC2通过FoxO1识别SREBP-2启动子区IRE1的结合位点,进而启动SREBP-2的转录调节。研究背景:亚临床甲减(SCH)是一种常见的危害人类健康的分泌疾病,在人群中发病率为4-10%。SCH与高血压、高脂血症、代谢综合症、动脉粥样硬化、心血管疾病密切相关。但是,目前的研究发现,SCH与糖尿病也具有密切的相关性。糖尿病患者合并SCH的机率为4-17%,并且糖尿病患者合并SCH后可加剧其病情及并发症的发生和发展。研究发现:糖尿病及糖尿病前期的患者合并SCH与无SCH的患者比较其肾功能异常及糖尿病肾病的发生率大大增加。糖尿病合并SCH的患者控制血糖的同时,良好的TSH水平的控制对于患者也十分重要。因此,探讨TSH对血糖的调节机制对糖尿病患者合并亚临床甲减患者的治疗十分重要。CRTC2是重要的调节糖代谢的因子,在维持机体血糖稳态的过程中起了重要的作用。CRTC2可受到cAMP升高的因素如胰高血糖素调节后,激活糖异生的重要酶PEPCK及G6P从而增加糖异生能力,提高血糖水平;而当机体禁食后,机体胰岛素水平增加,从而抑制CRTC2的活性,降低糖异生基因的表达,导致机体血糖水平下降。SCH患者的特征性表现促甲状腺激素(TSH)水平升高,而甲状腺激素(T4、T3)水平正常。研究发现:TSH与血糖水平也具有正相关性。而我们前期的研究看到:TSH在不同的组织细胞内可以增加cAMP的水平,导致脂代谢的异常。但是,目前对于TSH升高血糖的分子机制的研究还不甚清楚,尤其是TSH对于血糖的影响是否通过CRTC2来实现,目前尚无相关报道。本项目证实从体内外证实:TSH可以调节肝细胞内CRTC2的表达,并且该作用依赖于肝细胞膜上TSHR来实现。TSH通过CRTC2增加肝脏糖异生的能力,其机制是:TSH结合肝细胞膜上的TSHR,引起cAMP的产生增加,导致CRTC2脱磷酸增加,从而引起糖异生的关键酶PEPCK和G6P的转录活性增加,促进肝脏的糖异生水平,从而增加血糖水平。目的:1、通过构建SCH模型小鼠,确定SCH小鼠糖代谢水平异常及糖异生关键酶的表达上调。2、确定CRTC2在SCH小鼠及TSH处理HepG2细胞中表达增加。3、通过CRTC2基因敲除小鼠及siRNA CRTC2明确CRTC2在TSH引起的肝脏糖异生过程中发挥了重要作用。4、通过TSHR基因敲除小鼠及siRNA TSHR探讨TSH对CRTC2的调节依赖于TSHR来实现。5、使用cAMP的激动剂及抑制剂和PAK的阻断剂观察TSH对CRTC2的调控机制。6、明确TSH与CREB:CRTC2复合体的影响。研究方法:1、细胞培养:(1)HepG2细胞根据ATCC细胞培养标准进行培养(2)小鼠肝原代细胞据相关文献提取,培养基中加转铁蛋白、胰岛素、地塞米松。2、动物模型:(1)通过饮水给与他巴唑建立SCH模型。(2)繁殖及饲养 TSHR-KO 和 CRTC2-KO 小鼠。3、采用 Realtime-PCR 检测 PEPCK、G6P、TSHR、CRTC2 基因的表达。4、采用 Western Blotting 检测 PEPCK、G6P、TSHR CRTC2、CREB 及beta-actin蛋白水平变化。5、采用免疫荧光及免疫组化检测CRTC2在肝脏组织及细胞中的表达。6、TSHR、CREB、CRTC2基因沉默:特异性siRNA转染HepG2细胞以沉默 TSHR、CREB、CRTC2 表达。7、采用尾静脉测血糖的方法检测SCH模型小鼠OGTT及PTT实验。8、采用氧化酶法检测HepG2细胞中葡萄糖的含量。9、荧光素酶活性分析检测指标:含有CRE结合位点的PEPCK启动子区域重组质粒荧光素酶活性分析。10、耐量试验:小鼠给与口服葡萄糖耐量试验、丙酮酸耐量试验,观察SCH小鼠整体糖代谢水平的影响。11、细胞糖原磷酸化酶a活性分析。结果:1、促甲状腺激素增加血糖水平:他巴唑喂养14周,SCH组小鼠血清中TSH水平较对照组明显增加,而FT3和FT4水平无明显差异;SCH组小鼠糖代谢异常,空腹血糖水平增加,OGTT及PTT各时间点血糖水平较正常组增加;SCH肝脏中基因水平的PEPCK及G6P无论在空腹还是禁食又给食后均比正常组增加(P<0.01);蛋白水平的PEPCK及G6P结果与基因水平变化相似。但是,负责肝脏中糖原分解的Gpa的活性在过表达CRTC2的肝细胞和正常对照组之间没有明显差异。2、促甲状腺激素对CRTC2的上调作用:免疫组化及Western blotting结果显示:CRTC2在SCH小鼠肝脏中表达较正常组增加。而HepG2细胞给予Glucgaon和TSH处理后也明显增加CRTC2的表达,但是TSH对CRTC2的增强作用在加入Insulin处理后削弱。进一步采用免疫荧光技术检测发现TSH除了能增加HepG2细胞中CRTC2的表达外还能明显促进其入核。TSH对CRTC2的促进作用可通过脱磷酸化CRTC2的(S171)及(S136)位点来实现。3、CRTC2介导了促甲状腺激素引起的糖异生水平的上调:CRTC2敲除后,小鼠肝脏原代细胞中TSH处理48小时后,对PEPCK及G6P的基因及蛋白水平的上调作用较野生型比较明显降低;siRNA干扰掉CRTC2后,TSH对PEPCK启动子区的调节作用较对照组明显降低,但比单纯干扰CRTC2的组还要高些;同时,检测TSH对肝细胞中糖输出的影响发现:TSH能明显增加肝细胞中糖的输出,而CRTC2干扰后减弱了 TSH的作用,但是没有完全阻断。4、TSH对肝脏中CRTC2的调节依赖于肝脏的TSHR:TSHR基因敲除小鼠肝脏中CRTC2蛋白水平的含量较同窝对照野生型比明显下降,而同时给与TSHR基因敲除小鼠肝脏原代细胞TSH处理48 h后发现:野生型小鼠肝原代细胞中CRTC2的表达含量随着TSH浓度的增加呈剂量依赖性增加的趋势,而敲除型肝原代细胞中CRTC2的表达则无明显变化。同时我们观察到HepG2细胞中给与TSHR干扰后,TSHR基因水平较正常组下降约60%(P<0.01),CRTC2下降约35%,并且TSH与siRNA TSHR共同孵育后,CRTC2的表达量与siRNA TSHR组比较无统计学差异。5、TSH通过cAMP/PKA信号通路调节肝脏的CRTC2:TSH和FSK能明显增加HepG2细胞中CRTC2蛋白水平,SQ22526可削弱TSH对CRTC2的增加作用;同时我们观察到H89也能明显降低TSH对CRTC2的上调作用;在TSHR敲除小鼠给与Forskolin腹腔注射后发现蛋白水平的CRTC2无论野生型还是敲除型与其基因型一致的PBS对照组相比均有明显的增加;同时TSHR敲除小鼠给与H89腹腔注射后发现mRNA水平的CRTC2无论是野生型还是敲除型小鼠与其基因型一致的PBS对照组比较均有明显的下降;胞浆蛋白中PEPCK和G6P的表达在H89处理后明显减少,而p-CRTC2的表达量明显增加;胞核蛋白结果显示:CRTC2在H89处理后无论是野生型还是敲除型小鼠肝脏中CRTC2的表达量与其同基因型的PBS对照组相比均明显下降。6、TSH通过CREB:CRTC2复合物通路调节肝脏PEPCK的表达:TSH呈剂量依赖性的增加细胞中p-CREB(S133)的表达;而干扰CREB后PEPCK荧光素酶的活性明显降低,并且CREB干扰后可明显降低TSH对PEPCK荧光素酶活性的上调作用。CRTC2过表达明显增加PEPCK荧光素酶的活性,但是突变PEPCK启动子区CRE位点后其活性明显减低;CO-IP结果显示:TSHR敲除小鼠肝脏中CRTC2与CREB复合体较野生型比较明显减少。结论:1、SCH小鼠出现糖代谢紊乱及糖异生基因水平的表达增加。2、TSH通过脱磷酸化的方式促进肝中CRTC2的表达,并且对肝脏糖异生水平的调节通过CRTC2来实现。3、TSH通过TSHR/cAMP/PKA信号通路促进肝脏中CRTC2的表达。4、TSH通过调节CREB:CRTC2复合体在肝脏内的表达,进而影响肝脏中PEPCK的表达。