我国生物发酵工业产值超3000亿元,是我国战略产业的主攻方向之一。在生物发酵过程中,菌株常面临酸压力的逆境。提高菌株的酸耐受性,可降低发酵与其下游过程的中和剂用量与废水的排放,促进绿色制造。目前,大多数耐酸的研究关注其机理层面,合成生物学的发展使得通过人工设计高效抗酸模块以提高工业菌株的抗酸性能成为可能。在前期工作中,我们发现非编码小分子RNA（sRNA）DsrA和分子伴侣Hfq是有潜力的抗酸模块。本课题对DsrA-Hfq抗酸模块进行深入研究,通过建立基因组（genomic context）上抗酸模块的定向进化,实现DsrA-Hfq抗酸模块在大肠杆菌基因组上的改造,获得稳定遗传的耐酸菌株,并初步解析DsrA-Hfq突变株的抗酸机制。主要研究如下:成功构建基于CRISPR/Cas9和易错PCR技术对DsrA-Hfq抗酸模块进行基因组上的定向进化,发现以线性DNA形式为供体更优。筛选获得六株DsrA-Hfq抗酸模块突变株,与起始菌株MG1655相比,在中等酸压力下,突变株的终OD₆₀₀提高了41%～51%（2%葡萄糖的培养基）和51%～72%（7.5%葡萄糖的培养基）,其中最优的两株突变株H4和E11比DsrA-Hfq（WT）提高了12.6%和11.6%,且能稳定遗传。在极端酸压力条件下存活率的变化较大,提高1～100倍,如突变株H4没有明显差异,突变株E11提高10倍。因此,我们建议采用中等酸条件下的生长测试更合适于对菌株抗酸性能的评估。进一步,分析DsrA-Hfq模块提高大肠杆菌酸耐受的机理。测序分析发现DsrA和Hfq的启动子区和基因区均有突变。其中,Hfq启动子区的突变提高了其转录水平;推测Hfq基因区的突变改变了其与相应sRNA的亲和力。DsrA基因区的突变,推测其提高了DsrA稳定性或结合Rpo S、H-NS等调控因子m RNA的能力,从而促进了下游相关抗酸基因的表达。定量PCR结果显示抗酸调控基因gad E以及结构基因gad B、yba S、hde B和kat E的转录水平都得到显著提高。γ-氨基丁酸释放和NH₃释放研究也显示第二抗酸系统具有更高的活性。综上,推测第二抗酸系统、分子伴侣表达和自由基清除系统水平的提高是突变株抗酸性能提高的主要原因。本研究通过耦合sRNA DsrA和分子伴侣Hfq,并对其进行基因组上的定向进化,有效地提高大肠杆菌的抗酸性能。本研究为提高菌株酸耐受性的工程改造提供了新的思路与策略,也为基因元件器件、菌株定向进化提供了借鉴。