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研究背景神经病理性疼痛是一项重要的公共卫生问题,因对其发病机制研究的局限,目前临床治疗效果差。表观遗传调控神经病理性疼痛的发生发展。DNA甲基化是表观遗传学的重要分支,研究表明DNA甲基化影响神经病理性疼痛的调控。研究发现背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)中DNA甲基转移酶3a(DNA methyltransferases 3a,DNMT3a)的升高,可负调控μ阿片受体(Mu opioid receptor,MOR)和门控钾离子通道Kv1.2(voltage-gated potassium channels subunit Kcna2,Kv1.2)的表达,诱发神经元兴奋增加,是神经病理性疼痛产生的重要外周机制。我们通过研究坐骨神经慢性压迫损伤模型发现DRG八聚体转录因子1(Octamer transcription factor1,OCT1)表达增加;抑制OCT1表达可缓解大鼠疼痛行为。通过生物信息学预测OCT1可结合DNMT3a基因启动子区,由此我们提出假说:OCT1促进DNMT3a转录,上调MOR和Kv1.2基因的启动子区甲基化水平,抑制MOR和Kv1.2的表达,参与神经病理性疼痛的发生和慢性化,为神经病理性疼痛治疗提供新的理论依据。研究目的探讨OCT1是否参与神经病理性疼痛的调控及其作用机制。研究方法(1)制备大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤(Chronic construction injury,CCI)模型,检测OCT1在CCI大鼠DRG中转录和表达情况,OCT1在大鼠DRG中定位及与疼痛相关分子的共标情况,研究OCT1与神经病理性疼痛的关系。(2)研究DRG中OCT1对大鼠神经病理性疼痛的影响。I:抑制大鼠DRG中OCT1是否影响大鼠神经病理性疼痛的产生:应用DRG显微注射技术,先对大鼠DRG显微注射OCT1 siRNA,再制备CCI模型,观察大鼠机械缩足阈值、热缩足潜伏期、冷缩足潜伏期等疼痛行为和运动功能的变化。II:抑制CCI大鼠DRG中的OCT1表达是否影响大鼠神经病理性疼痛的维持:先制备大鼠CCI模型,再行大鼠DRG显微注射OCT1siRNA,观察大鼠疼痛行为变化。III:过表达大鼠DRG中的OCT1对大鼠神经病理性疼痛发生发展的影响:采用腺相关病毒载体rAAV5对大鼠DRG显微注射rAAV5-OCT1,过表达大鼠DRG中OCT1,然后观察大鼠疼痛行为的变化。(3)探讨DRG中OCT1对神经病理性疼痛调控的机制。I:采用用qRT-PCR、Western Blot方法检测第(2)部分各实验组大鼠DRG中OCT1、DNMT3a、MOR、Kv1.2的mRNA和蛋白含量,验证在体抑制CCI大鼠DRG中OCT1表达能否下调DNMT3a的转录和表达,并增加CCI大鼠DRG中MOR和Kv1.2的转录和表达;过表达大鼠DRG中OCT1能否上调DNMT3a的转录和表达,下调MOR的转录和表达。II:验证抑制DRG中OCT1表达上调是否能够提高吗啡的镇痛效果,确认大鼠DRG中OCT1参与神经病理性疼痛通过下游分子MOR的功能。结果1.CCI引起外周神经损伤后,大鼠受损DRG中OCT1表达从术后3天升高,一直持续至术后14天。2.OCT1在大鼠DRG中大、中、小细胞中均有分布,且主要分布在大、中细胞中。OCT1与神经元核抗原(NeuN),谷氨酰胺合成酶(GS)共标;OCT1与神经丝蛋白-200(NF200),生物素化植物凝集素B4(IB4)、基因相关肽(CGRP)共标。3.DRG中预先注射OCT1 siRNA能够阻断CCI诱导大鼠产生神经病理性疼痛的症状。CCI术后采用siRNA基因敲减的方法降低大鼠DRG中OCT1的表达能够缓解大鼠CCI引起的痛敏症状。4.DRG中升高OCT1的表达能够诱导大鼠产生对机械刺激和温度刺激的痛觉过敏症状。5.无论DRG显微注射技术、siRNA基因敲减还是rAAV5载体过表达均不影响大鼠的运动功能。6.CCI能够引起受损DRG内OCT1和DNMT3a的mRNA与蛋白含量升高,MOR和Kv1.2的mRNA与蛋白水平下降。抑制OCT1的表达能够下调CCI引起的DNMT3a的高表达同时上调MOR和Kv1.2的表达。模拟神经病理性疼痛中DRG内OCT1的高表达能够上调DRG内DNMT3a的转录和表达并下调MOR和Kv1.2的mRNA和蛋白水平。7.OCT1能够与DNMT3a、MOR及Kv1.2共表达于DRG细胞中。8.DRG内基因敲减OCT1可以阻止DNMT3a对MOR和Kv1.2的调控作用。9.OCT1调控CCI引起的神经病理性疼痛最终是通过MOR和Kv1.2的功能,并造成中枢敏化。结论背根神经节中转录因子OCT1可转录激活DNMT3a,促进DNMT3a表达,间接负调控下游分子MOR和Kv1.2,参与神经病理性疼痛的发生和维持。