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目的 刘德新等人已通过噬菌体抗体库技术绕过免疫成功克隆了人抗地高辛单链抗体(human single-chain variable fragment of anti-Dig antibody, ADAscFv)，并使其在大肠杆菌中得到可溶性表达，目前需依据抗体性质的特点进行分离与纯化。由于不同蛋白质的纯化无通用策略，给制备带来了较大难度和特殊性，本实验的目的即通过试用不同的纯化方法（盐析、阴离子交换、凝胶过滤等），探明适合纯化ADAscFv的最佳纯化方法及条件，为下一步制备诊断Dig中毒的试剂盒和探明ADAscFv对Dig中毒的拮抗作用等后续研究提供实验室依据。 方法 ①培养大肠杆菌(E.coli)HB2151，进行可溶性表达ADAscFv, 离心制备菌液上清，分别经酶联免疫吸附实验（ELISA）和聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）对表达产物进行活性及表达量的检测。②采用不同饱和度硫酸铵分级盐析法（SF）对上述表达物进行初步分离,分别用ELISA和SDS-PAGE法对回收的样品进行活性及纯度的检测，确定硫酸铵的最佳饱和度及适合的温度、沉淀所需时间等条件。③采用HiTrap Q HP(1cm×5cm)强阴离子交换层析柱，通过改变洗脱液的盐浓度、pH值等洗脱条件，对盐析后的样品进行阴离子交换层析法（AEC）纯化, 收集洗脱回收样品用ELISA和SDS-PAGE方法对纯化所得样品进行活性及纯度的检测。④为提高纯化效率，在快速蛋白液相系统（FPLC）对盐析后的样品进行AEC制备级纯化,经不同盐离子(NaCl)浓度的0.05mol/L Tis-HCl溶液梯度洗脱，分别回收各洗脱峰流出样品，用ELISA和SDS-PAGE法对纯化所得样品进行活性及纯度的检测。⑤采用凝胶过滤层析法（GFC），试用不同的纯化条件,对盐析后的样品进行纯化，分别对洗脱峰回收洗脱流出样品，用ELISA和SDS-PAGE对纯化所得样品进行活性及纯度的检测。 结果 ①经ELISA检测显示E.coli HB2151可以稳定性地可溶性表达ADAscFv于菌液培养上清中，SDS-PAGE分析表明菌液上清中仍含大量杂蛋白，需进一步分离纯化。②对不同饱和度硫酸铵盐析后所获样品，分别经ELISA及<WP=5>SDS-PAGE检测，显示0-50%饱和度硫酸铵盐析所获样品中含有一约36kDa条带，其分子量与预期值(ADAscFv的分子量)相符，且收率高，但杂蛋白也较多。 ③对硫酸铵盐析初步纯化的样品进行阴离子交换层析，回收的样品进行ELISA检测显示洗脱液为0.05mol/L Tris-HCl溶液,pH值9.0，盐离子（NaCl）浓度为0.2mol/L时,纯化所获样品活性高，且SDS-PAGE显示约在36kDa处有一条纯带。 ④在FPLC系统对硫酸铵盐析的样品进行阴离子交换层析，经含NaCl的0.05mol/L Tis-HCl溶液阶梯洗脱，FPLC检测仪显示6个洗脱峰，于第2峰（相当于NaCl浓度为0.2mol/L）收集的样品进行ELISA检测，其活性最高，SDS-PAGE显示分子量约为36kDa的一条纯带，估计回收率至少20%。⑤使用XK16/60空柱，填加基质superdex x75，在FPLC系统进行GFC纯化硫酸铵盐析后的样品，FPLC检测仪显示的流出峰为组峰，且洗脱回收的样品被大量稀释，上样量有限制。 结论 含分泌型ADAscFv的大肠杆菌培养上清经0-50%饱和度硫酸铵盐析粗分离后，在FPLC系统建立阴离子交换层析，选用HiTrap Q HP型强阴离子交换层析柱（1cm(5cm），使用盐离子为NaCl的pH 9.0 0.05 mol/L Tris-HCl溶液阶梯洗脱纯化，于第二峰收集洗脱样品，可获得具有生物活性及高纯度的ADAscFv，该方法操作容易，重现性好，选择性高，所需费用相对低廉，纯化周期短，为快速高效地制备适于临床应用的ADAscFv提供了实验室依据。