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鼻咽癌是我国南方及东南亚地区常见恶性肿瘤之一,有“广东瘤”之称。复发和转移成为鼻咽癌治疗失败的主要原因。肿瘤干细胞被认为是肿瘤增殖、转移和复发的根源。端粒酶在包括鼻咽癌在内的大多数肿瘤中高表达。PinX1为主要的端粒酶抑制剂。上皮间充质转化(EMT)为肿瘤转移常见的生物学过程。目前对于鼻咽癌肿瘤干细胞、端粒酶与EMT的作用关系尚不清楚。因而采用端粒酶抑制剂靶向调控端粒酶活性以抑制肿瘤干细胞及EMT的表达具有重要意义。一、CD133+鼻咽癌干细胞的分选及生物学特性目的:探究以CD133作为干细胞标志物,分选CD133+细胞并探究其生物学特性方法:磁珠分选将鼻咽癌CNE2细胞分选为CD133+和CD133-细胞,流式细胞术及荧光免疫对分选的效率进行验证,体外成球、CCK-8以及Transwell法检测细胞的体外成球、细胞增殖、侵袭、迁移能力。结果:1.以未加标志物的CNE2细胞为对照,对磁珠分选后的细胞进行流式及荧光免疫检测,结果显示CD133+细胞分选成功。2.将分选的细胞体外诱导成球培养,10天后CD133+细胞形成的肿瘤细胞球半径明显大于CD133-细胞,且成球个数更多。3.CD133+细胞的增殖速度、迁移、侵袭能力明显高于CD133-细胞。结论:鼻咽癌CNE2细胞磁珠分选成功分获得CD133+鼻咽癌肿瘤干细胞,CD133+鼻咽癌干细胞的体外成球、增殖、迁移、侵袭能力等肿瘤干细胞特征明显强于CD133-鼻咽癌细胞。二、PinX1基因靶向端粒酶抑制鼻咽癌干细胞EMT的研究目的:探讨PinX1靶向端粒酶对鼻咽癌干细胞生物学特性及其EMT的影响方法:通过QPCR及Western blot方法检测在CD133+/-细胞中EMT的表达;并在CD133+细胞中转染PinX1过表达质粒及空载质粒后端粒酶的活性,并将转染获得的细胞进行干细胞诱导成球,CCK-8法观察细胞增殖情况,Transwell检测细胞的侵袭、迁移情况,QPCR及Western blot法检测鼻咽癌肿瘤干细胞的EMT标志物、转录调控因子的表达。结果:1.对鼻咽癌EMT标志物的表达进行检测,CD133+鼻咽癌干细胞上皮化标志物E-cadherin明显低于CD133-细胞,间充质标志物Vimentin明显高于CD133-细胞。2.CD133+细胞转染PinX1过表达质粒后,端粒酶活性明显被抑制,在干细胞生物学特性方面,细胞的成球能力明显减弱,干细胞球半径和成球个数明显减少;细胞的增殖、侵袭、迁移能力明显低于空载质粒组。3.CD133+细胞转染PinX1过表达质粒后,E-cadherin表达明显高于空载质粒组,Vimentin表达明显低于空载质粒组;EMT转录调控因子Snai1、Twist和Zeb1的表达明显低于空载质粒组。结论:1、CD133+鼻咽癌干细胞较CD133-鼻咽癌细胞表现出更强的EMT潜能;2、PinX1基因能够抑制CD133+鼻咽癌干细胞的端粒酶活性,从而抑制鼻咽癌干细胞的生物学特性并对其表现出的EMT潜力产生抑制作用。