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目的1、通过基于iTRAQ技术的蛋白质谱分析对吸烟者血清和非吸烟者血清作用于ARMS2/HTRA1高危型及野生型RPE细胞前后蛋白质谱的测定,筛选组间差异蛋白,并对其进行功能和通路富集分析,探究吸烟与ARMS2/HTRA1高危基因型在AMD发病中的作用机制,寻找二者之间关联及影响的直接证据。2、应用CRISPR/Cas9基因编辑技术对干细胞进行靶基因修饰,建立ARMS2高危型、HTRA1高危型纯合优化干细胞系,从而达到将紧密连锁的ARMS2/HTRA1高危基因分开研究的目的,为之后特异性的分析ARMS2以及HTRA1的分子生物学特性,明确AMD真正的致病基因提供了细胞模型。方法1、从预筛选的健康人群分别收集吸烟者血清和非吸烟者血清,探索最佳血清作用浓度。收集角膜移植后的供体眼球,分离培养ARMS2/HTRA1高危型及野生型个体来源的人原代RPE细胞。同时,将ARMS2/HTRA1高危型及野生型个体来源的iPSCs定向诱导分化为iPSCs-RPE细胞。将预混的吸烟者血清和非吸烟者血清分别作用于ARMS2/HTRA1高危型及野生型的原代RPE细胞7天后,提取各实验组的细胞总蛋白,进行基于iTRAQ技术的蛋白质谱检测,Q-Exactive质谱仪检测肽段信号,Thermofisher Proteome Discoverer1.3/1.4软件进行数据采集及分析,得到差异蛋白谱。筛选p_value<0.05和ratio值1.2倍(上调1.2、下调0.833)的蛋白为可信的差异蛋白。对可信的差异蛋白进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。重复蛋白质谱样品准备的作用条件于高危型及野生型iPSCs-RPE细胞,通过Real-time PCR、Westernblot、IF等实验方法验证筛选出的差异蛋白。通过用FITC标记的感光细胞外节段(POS)与吸烟者血清和非吸烟者血清作用后的高危型iPSCs-RPE细胞共培养,检测各组细胞吞噬功能的差异。2、构建HTRA1过表达慢病毒感染ARPE-19细胞系,嘌呤霉素筛选获得HTRA1过表达稳转细胞株后,检测Caveolin-1的表达水平,探索HTRA1过表达与Caveolin-1表达的关系。3、应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,根据靶基因序列设计sgRNA,构建打靶载体,对ARMS2/HTRA1高危型干细胞进行靶向基因修饰,建立ARMS2高危型、HTRA1高危型纯合优化干细胞系。结果1、高通量质谱分析发现吸烟者血清作用下,不同于野生型的高危型的差异蛋白有400个,筛选剔除个体差异蛋白,得到Caveolin-1等7个具有明显差异的可信蛋白。通过Real-time PCR、Western blot和IF等实验验证了吸烟者血清暴露后,高危型RPE细胞中Caveolin-1在mRNA和蛋白水平均表达上调,且RPE细胞的吞噬功能增强。2、过表达HTRA1的稳转细胞株中,Caveolin-1在mRNA水平和蛋白水平表达显著增强。吸烟者血清与AMD高危基因HTRA1过表达对于Caveolin-1蛋白表达增强有协同叠加作用。3、成功建立ARMS2高危型、HTRA1高危型纯合优化干细胞系,为之后ARMS2/HTRA1高危基因在AMD致病机制中的分别研究提供细胞模型。结论蛋白组学分析吸烟者血清刺激后,ARMS2/HTRA1高危型RPE细胞的差异蛋白变化明显大于野生型,这些差异蛋白表达的变化很可能与AMD的发病相关。该研究证明了AMD的高危基因HTRA1表达上调和AMD高危环境因素吸烟,通过上调Caveolin-1的表达,代偿性增强RPE细胞吞噬功能,引起氧化负担加重,导致废物的积累、消除及随后的炎症反应最终导致感光细胞的破坏,从而促进AMD的发生和发展。