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研究背景脑卒中是与脑组织损伤有关的一种急性脑血管事件,是目前威胁人类健康的重要疾病之一,也是致残的主要原因之一。美国每年有79.5万人罹患中风。其中大约61万是为新发病例,18.5万为复发病例,平均每40秒美国有1人发生中风。其中缺血性脑卒中占大约85%左右,其余为出血性脑卒中。而且随着人口老龄化,缺血性脑卒中的发生率成逐年上升趋势。溶栓和血管再通是缺血性脑卒中的主要治疗手段。目前静脉应用重组纤溶酶原激活物(recombinant plasminogen activator,rtPA)溶栓的治疗时间窗狭窄,而且在卒中的治疗指南中,rtPA的应用有严格的适应证和禁忌证,仅仅2%～5%的中风患者有机会得到这种治疗,而且接受治疗的患者中大约有50%的患者会出现脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)。CIRI 的病理生理机制极其复杂,有多个损伤级联反应参与,例如体内离子失衡,ATP损耗,大量释放兴奋性神经递质,氧自由基过度产生、炎性级联反应和细胞凋亡等。因此寻求多靶点的神经保护药物,试图减轻CIRI成为医学界研究的重要课题。尽管针对这些机制,动物实验中一些抗炎剂、抗氧化剂等显示了一定的治疗效果,但是众多临床实验未达到预期效果。所以近年来人们愈发强烈地意识到寻找具有多种生物学活性,能多靶点、多个途径治疗卒中,而且毒副作用小的天然植物有效成分已为研究的热点,以便为新型神经保护剂的开发和研制提供更加广阔的思路。芝麻酚(sesamol)又称5-羟基-1,3-苯并二氧杂环戊烯,胡麻属植物的天然提取物,是芝麻油的主要香气成分,芝麻油的脱脂抗氧化剂之一,呈水溶性,能通过血脑屏障,具有多种生物学活性。芝麻油为中国和印度等东南亚国家的传统健康补充剂,同其他的膳食油(如花生油、玉米油、葵花籽油)相比,芝麻油具有更好的抗高血压、调解血脂、抗疲劳和抗衰老的效果。目前芝麻已经被西方中药师所接受,并用于各种治疗目的。动物实验表明芝麻酚具有很强的抗炎、抗氧化、抗凋亡和免疫调节等特点,其比白藜芦醇和葵花籽油衍生物具有更强的抗氧化性能和抗肿瘤特性。它对药物和理化因素导致的重要脏器损伤有效。目前一些临床研究也发现芝麻衍生物的抗疲劳、抗衰老、抗癌、调脂、降压、减轻糖尿病并发症等功效。而且近年来人们又发现芝麻酚有神经保护功能,其在3-硝基丙酸、链脲霉素等诱导的认知功能障碍、糖尿病相关性认知功能障碍,鱼藤酮诱导的帕金森大鼠模型中均显示显著的治疗疗效;研究还发现芝麻酚有助于维护神经血管单元细胞的完整性,改善糖尿病患者血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的通透性;给大鼠长期喂食芝麻酚可以影响其大脑组织中神经生长因子的水平和大麻素信号转导系统而发挥抗抑郁性能,而且其功效与经典抗抑郁药阿米替林相似,但副作用更小。体外研究也发现,芝麻酚在神经胶质细胞,可以减少NO、H202的生成,减弱单胺氧化酶活性,发挥神经保护作用。芝麻酚对参与中风的病理机制中的炎性反应、氧化应激和神经细胞凋亡级联反应都有抑制作用,而且对中风的风险因素如高血压、糖尿病、高脂血症等都显示出治疗作用,如果证实芝麻酚是治疗中风的多靶点、多维度起作用的理想神经保护剂,将会有很重要的意义。本研究第一部分采用大鼠的脑缺血再灌注模型,探讨芝麻酚对神经功能缺损评分、脑梗塞体积、脑水肿以及脑组织病理学改变以及神经细胞凋亡的影响;第二部分评估芝麻酚对脑缺血再灌注损伤的氧化应激,凋亡级联反应和炎性反应的影响,以了解芝麻酚发挥神经保护作用的机制。第一部分芝麻酚对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护效果的研究目的:探讨芝麻酚对脑缺血再灌注损伤大脑中动脉闭塞模型的脑保护效果。方法:成年SD大鼠随机分为假手术(sham)组,脑缺血再灌注(MCAO)组、脑缺血再灌注+芝麻酚小剂量(MCAO+sesamol A)组和脑缺血再灌注+芝麻酚大剂量(MCAO+sesamolB)组,sham组只暴露和游离大脑中动脉,不经历缺血再灌注的过程。其余三组大脑中动脉阻塞2 h,再灌注24 h。在MCAO+sesamol A组和MCAO+sesamol B组诱导MCAO前,分别连续7 d腹膜注射15mg·kg-1·d-1和25mg·kg-1—d-1的芝麻酚。Sham组和MCAO组连续7 d注射相同剂量的溶剂作为对照。脑缺血再灌注前后观察各组大鼠的生命体征(心率、呼吸、血氧饱和度和体温)。在脑缺血2 h再灌注24 h后,采用盲法对大鼠进行神经功能缺陷评分;TTC法对脑组织切片进行染色,并计算脑梗死体积,干湿重法测量脑水肿程度;并通过HE染色观察神经细胞的病理组织学改变、TUNEL法观察神经细胞凋亡的表达,SABC免疫组化染色法检测脑组织caspase-3的表达。结果:与sham组相比,MCAO组的大鼠神经功能缺损评分明显降低(P<0.05)。而MCAO+sesamol A组和MCAO+sesamol B组神经功能缺陷评分与MCAO组相比显著得到改善(P<0.05)而且呈现剂量依赖性;而且MCAO+sesamol A组和MCAO+sesamol B组与MCAO组比较脑梗死体积、脑水肿的程度均显著减轻(P<0.05);sham组神经元和组织毛细血管的形态结构基本正常,MCAO组的神经元细胞发生皱缩,细胞核染色深,有些呈现出三角形,核仁消失,伴有空泡形成,细小血管网中断。MCAO+sesamol A组和MCAO+sesamol B组的细胞形态学改变明显减轻,而且MCAO+sesamol B组改善更明显;Tunel染色结果显示sham组仅有少量的凋亡阳性细胞,与sham组相比较MCAO组在光镜下可见大量的凋亡细胞。与MCAO组相比,MCAO+sesamol A组和MCAO+sesamol B有较低的细胞凋亡指数,大剂量组凋亡阳性细胞数目减少更加明显;免疫组化染色结果显示,脑缺血2 h再灌注24 h sham组仅见少量的caspase-3阳性细胞,与sham组比较,MCAO组caspase-3阳性细胞大量增加(P<0.01)。与MACO组比较MCAO+sesamol A组和MCAO+sesamol B组caspase-3阳性细胞数明显减少,MCAO+sesamol B组减少更显著(P<0.01)。结论:在脑缺血再灌注损伤大脑中动脉闭塞大鼠模型中预防性腹腔内注射芝麻酚可以改善大鼠脑缺血再灌注损伤导致的神经功能缺陷,减小脑梗塞体积,减轻脑水肿,改善神经细胞的病理学改变,减轻细胞凋亡。第二部分 芝麻酚对脑缺血再灌注损伤氧化应激反应、细胞凋亡和炎性反应的影响目的:探讨芝麻酚对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤急性期保护作用的机制。方法:SD大鼠被随机分为3组:假手术组(sham);大脑中动脉闭塞组(middle cerebral artery occlusion,MCAO);大脑中动脉闭塞+芝麻酚组(MCAO+Sesamol)。线栓法制作大脑中动脉闭塞模型,脑缺血2h,再灌注24h。MCAO+Sesamol组在脑缺血再灌注模型制作前,连续7d腹腔注射25 mg·kg-1·d-1的芝麻酚进行预处理。Sham组只分离暴露大脑中动脉,不做缺血再灌注手术。Sham组和MCAO组在相同条件下,连续腹腔注射生理盐水作为对照。再灌注后24 h后,评估缺血脑组织丙二醛(MDA)含量和抗氧化应激物质:超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的水平。此外,应用逆转录-定量聚合酶链反应(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)方法检测大脑组织中炎性细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-8的水平。最后,应用蛋白免疫印迹(Western Blot)法测定Bcl-2、Bax和caspase-3的表达。结果:脑缺血2 h,再灌注24 h后,与sham组比较,MCAO组的大鼠脑组织中脂质过氧化产物MDA的水平显著升高(4.15±0.36 vs.2.20±0.25,P<0.05);而抗氧化物SOD(65.15±7.57vs.115.25±10.24,P<0.05)、GSH(3.55±0.52vs.4.93±0.75,P<0.05)和 GPx(3.21±0.96 vs.5.79±1.02,P<0.05)的水平显著降低;促炎性介质 IL-6(1.17±0.85 vs.0.20±0.07,P<0.05)和 TNF-αmRNA(1.40±0.16vs.0.32±0.06,P<0.05)表达增高;凋亡相关蛋白 Bax(1.10±0.08vs.1.80±0.25,P<0.05)和 caspase-3(1.13±0.26vs.0.36±0.05,P<0.05)的水平升高,而 Bcl-2 水平降低(0.50±0.03 vs.1.60±0.09,P<0.05)。与 MCAO组相比,在脑缺血再灌注前7d连续使用芝麻酚25 mg·kg-1·d-1进行预处理,可以降低MDA的含量(2.45± 0.44 vs.4.15±0.36,.P<0.05)、提高脑组织的抗氧化 SOD(92.15±8.82 vs.65.15±7.57,P<0.05)、GSH(4.45±0.55 vs.3.55±0.52,P<0.05)和 GPx(5.25±1.07 vs.3.21±0.96,P<0.05)的水平。此外,在芝麻酚干预下,促炎症细胞因子IL-6(0.38±0.04 vs.1.40±0.11,P<0.05)和 TNF-αmRNA 表达明显降低(0.33±0.08vs.1.17±0.35,P<0.05),凋亡相关蛋白 Bax(1.10±0.08vs.1.80±0.25,P<0.05和 caspase-3(0.70±0.06vs.1.13±0.26,P<0.05)的水平较MCAO组显著下调,而Bcl-2的水平得到提高(1.20±0.09 vs.0.50±0.03,P<0.05)。结论:芝麻酚可通过减弱氧化应激反应,抑制细胞凋亡和炎症级联反应减轻脑缺血再灌注损伤。