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棉花是世界上重要的纤维作物和油料作物。黄萎病是伴随棉花整个生育期的主要病害之一,严重影响棉花产量和纤维品质。抗黄萎病功能基因的挖掘及抗病机制研究是棉花种质创新亟需解决的关键问题之一。本实验室前期从黄萎病菌诱导下的海岛棉全长cDNA文库和转录组文库中筛选到GbEDS1,并初步证明GbEDS1基因能够提高拟南芥对黄萎病菌的抗性,但该基因发挥抗病功能的分子机制及在棉花中的功能尚未深入研究。本论文将开展以下几方面的研究:(1)以已经获得的转GbEDS1拟南芥T4代纯合株系为材料,从分子生物学、细胞学、生理生化和表型水平解析GbEDS1抗病分子机制;(2)利用病毒介导的基因沉默技术干扰棉花内源EDS1的表达,研究对黄萎病抗性的影响及关联的信号通路、产物的变化。获得主要的研究结果如下: 1.棉花EDS1基因高度保守,GbEDS1基因序列与GrEDS1同源性为99%,与GhEDS1和GaEDS1同源性分别为98%和97%。GbEDS1基因启动子区预测含有抗病、抗氧化、干旱、激素调控等多种调控元件。 2.转GbEDS1基因拟南芥表现出对黄萎病抗性增强。接种黄萎病菌后,转基因拟南芥的病指为46.42~50.00,显著低于野生型对照的病指(73.15)。 3.转基因拟南芥和野生型拟南芥在接菌后SA含量都呈现增加的趋势。而转基因拟南芥的SA含量在接菌前后(48 hpi除外)均高于野生型,并且在0、6、12和36 hpi分别达到显著或极显著水平;转GbEDS1基因拟南芥显著提高了植株体内H2O2的水平,并且在0、6和12 hpi显著高于野生型对照;转GbEDS1基因拟南芥的POD酶活低于野生型对照,并且在0和48 hpi达到极显著水平。 4.利用VIGS方法抑制GbEDS1基因的表达,对GbEDS1沉默的棉花进行接菌,抗病性调查显示GbEDS1沉默棉株开始发病的时间较对照植株提前,25 dpi沉默GbEDS1棉株病情指数(69.95)显著高于对照植株(42.27),表明抑制GbEDS1基因表达显著降低了植株的抗病性。生化物质测定表明抑制GbEDS1基因表达,棉株体内SA和H2O2较对照显著降低。 5.qPCR分析显示,GbEDS1超量表达、GbEDS1抑制表达和野生型植株中SA路径相关基因都呈现统一的表达趋势:与0 hpi相比,接菌后超表达拟南芥和野生型对照中AtEDS1和AtNDR1都显著上调;与野生型对照相比,超量表达GbEDS1的株系中AtEDS1和AtNDR1表达水平显著提高。与上述结果相反,在GbEDS1抑制表达植株中,棉花EDS1和NDR1的表达呈现相反的趋势。 综合以上结果,本研究初步证明棉花EDS1基因具有很强的保守性,海岛棉GbEDS1在抗黄萎病反应中具有重要的正向调控作用,其通过调节植株体内SA和H2O2水平调控植株的抗病性。GbEDS1拮抗SA下游NPR1-PR分支路径;GbEDS1调节的SA的积累依赖于NDR1的参与。