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背景：乳腺癌是全球范围内的高发性癌症,在治疗时多药耐药是对化疗药物疗效及病人康复的一大障碍,而目前多药耐药的机制仍不清楚。研究表明,乳腺癌耐药蛋白BCRP/ABCG2(breast cancer resistance protein,BCRP)在乳腺癌组织中差异表达,是产生获得性耐药的重要原因。甲基化模式的改变有可能是导致其耐药的机制之一,并且在对耐药细胞株的研究中发现,多聚(ADP-核糖)聚合酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP-1]的表达也影响着细胞药物耐受的表型,且发现PARP-1能作用于DNMT1的启动子区,影响其甲基化水平,从而调控DNMT1的功能。因此,本研究采用盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone,MIT)诱导乳腺癌细胞MCF-7,从而建立耐药程度不同的耐药细胞系,并以耐药细胞系为模型,检测全基因组的甲基化情况、甲基化结合蛋白的表达变化。然后利用RNA干扰技术构建PARP-1低表达细胞株,通过亚硫酸氢盐测序法(BSP)检测特定基因的启动子甲基化水平,初步探讨在米托蒽醌诱导的乳腺癌细胞耐药表型中,PARP-1是否通过影响其DNA甲基化模式的改变从而间接调控乳腺癌细胞的耐药。方法:用终浓度为0.005,0.01,0.02,0.04μmol/L的米托蒽醌持续诱导MCF-7细胞30天,筛选耐药细胞,并用未做处理的MCF-7为对照组。采用CCK-8法以及流式细胞术检测不同药物浓度处理的乳腺癌细胞对米托蒽醌的耐受性,确定是否耐药诱导成功。蛋白免疫印迹杂交分别检测MCF-7/mit耐药细胞系中甲基化结合蛋白(Methyl-DNA-binding protein,MBD)MBD1、MBD2及MBD4的蛋白表达水平。利用毛细管电泳法检测MCF-7/mit全基因组甲基化水平。利用RNA干扰技术,构建PARP-1低表达细胞株,再通过BSP,检测对照组及PARP-1低表达细胞株的ABCG2、MBD4以及DNMT3b的基因启动子区甲基化水平。结果:与对照组MCF-7细胞相比,随着米托蒽醌药物浓度的增加,经CCK-8法及流式细胞术检测发现细胞对米托蒽醌的耐受性逐渐增加。Western blot检测MCF-7/mit耐药细胞株中甲基化结合蛋白的表达,发现MBD1、MBD2、MBD4的表达均呈降低趋势,且MBD4的降低尤为明显(P<0.05)。毛细管电泳法检测MCF-7/mit耐药细胞株中全基因组甲基化水平,随着药物浓度的不断升高,其全基因组甲基化水平不断降低。利用慢病毒载体构建PARP-1缺陷细胞株,经western blot检测,与对照组相比,缺陷细胞株的PARP-1蛋白表达水平显著降低。用BSP法检测PARP-1正常表达的MCF-7细胞株与PARP-1干扰细胞株,与对照组相比,ABCG2、MBD4以及DNMT3b基因启动子区甲基化水平在PARP-1低表达细胞株中都降低,分析发现在ABCG2启动子区中227、308、499、520以及538bp位置,PARP-1干扰细胞株发生了高甲基化而正常细胞中没有发生甲基化。其可能参与这些位点的转录因子为TFAP2A及KDM5A,同时在DNMT3b基因启动子区中195、288、312以及345bp位置,PARP-1干扰细胞株发生了高甲基化而正常细胞中低甲基化。其可能参与这些位点的转录因子为EGR3、RARG、YY、NFKB1CYB5R、POU2F1、DUSP26等。结论:成功构建了对米托蒽醌不同程度耐药的MCF-7/mit耐药细胞系,并且成功构建了PARP-1缺陷细胞株,为研究乳腺癌耐药蛋白介导的肿瘤细胞耐药提供了细胞模型。乳腺癌耐药细胞系中全基因组甲基化水平降低以及甲基化结合蛋白的表达降低可能是乳腺癌细胞产生获得性耐药的表遗传机制之一。干扰PARP-1后,对ABCG2、MBD4、DNMT3b的基因启动子区的甲基化水平的研究中发现,与对照组相比,PARP-1干扰细胞株中,ABCG2、MBD4和DNMT3b的启动子区甲基化水平降低,推测PARP-1可能协同MBDs及DNMTs,通过转录因子的作用,调控ABCG2的表达。并且在ABCG2及DNMT3b基因启动子区筛选到的差异甲基化位点,可能是促使ABCG2基因差异表达的特异性甲基化位点,为逆转ABCG2介导的多药耐药提供了新的靶点。