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近年来化学农药的大量使用造成了严重的农药残留。使用生防菌剂、微生物有机肥等生物防治方法代替化学农药仔农业发展中表现出良好的应用前景。解淀粉芽孢杆菌能分泌多种抗菌素,是生防菌家族中的重要成员之一,在农业生产领域具有广阔的应用前景。本实验室从健康黄瓜根际土壤中筛选到一株解淀粉芽孢杆菌SQR9,SQR9的菌体发酵液对黄瓜生长有明显的促进作用。利用SQR9制成的生物有机肥对土传黄瓜枯萎病具有很好的防控效果。本文在实验室平板培养条件下检测了解淀粉芽孢杆菌SQR9的抗菌谱;鉴定了SQR9拮抗不同土传病原真菌的关键活性物质及在SQR9-土传病原真菌对峙时的调控表达;分析了SQR9拮抗病原细菌茄科劳尔氏菌的关键活性物质;探索了SQR9在番茄根际原位条件下拮抗基因的表达水平。获得了以下结果:1.平板对峙实验发现解淀粉芽孢杆菌SQR9及其发酵液对土传病原真菌大丽轮枝菌、核盘菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、山药腐皮镰刀菌以及烟草疫霉的生长有较强的抑制作用,能形成明显的抑菌圈;分析SQR9基因组发现bmyDABC、fenEDCBA、srfAA-AD和dhbEDCBA等四种与芽孢杆菌拮抗真菌能力密切相关的物质合成基因簇,这四个基因簇分别负责合成bacillomycin D、fengycin、surfactin等三个非核糖体途径合成的脂肤（NRPS）和一个铁载体bacillibactin;在转录和翻译水平,这四种物质的合成和翻译在与病原真菌对峙时都与单独培养的SQR9有明显的差异;通过构建四种物质的合成缺失突变体,并用突变体发酵液进行平板牛津杯对峙试验,验证了在与不同病原真菌对峙的过程中,SQR9的拮抗活性存在明显差异,提取物在牛津杯试验中面对不同的病原菌,产生的拮抗圈在P≤0.05水平上有显著差异,这表明SQR9在与不同病原真菌对峙时调节了其拮抗物质的合成水平。Bacillomycin D是SQR9面对病原菌尖孢镰刀菌的主要脂肽类物质;fengycin参与了SQR9对大丽轮枝菌、尖孢镰孢菌、山药腐皮镰刀菌和疫霉的拮抗过程;surfactin在SQR9对核盘菌、立枯丝核菌和山药腐皮镰刀菌的平板拮抗过程中是主要的参与物质。SQR9分泌的铁载体bacillibactin参与了SQR9对所试6种病原真菌的拮抗。这一发现对于揭示病原真菌与拮抗菌之间的相互作用关系起到了重要的作用,对于生防菌在农业生产上的应用具有一定程度的指导作用。2.平板喷菌试验发现SQR9对病原细菌茄科劳尔氏菌有明显的抑制作用,分析SQR9基因组中与拮抗作用相关的物质合成基因,发现除bmyDABC、fenEDCBA、srfAA-AD、dhbEDCBA以外,SQR9基因组中存在已报道与细菌拮抗活性有关的聚酮类物质合成基因簇mlnA-Ⅰ、dfnAYXB-M、baeB-E,acpK,baeG-NR和bacA-EywfG。敲除参与其中7种拮抗物质合成过程的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（Sfp）合成基因sfp以及不依赖Sfp途径合成的二肽bacilysin合成相关基因bac,使用相应的突变体发酵液对茄科劳尔氏菌进行牛津杯平板对峙试验,结果表明:不依赖Sfp合成的二肽bacilysin不参与SQR9对茄科劳尔氏菌的拮抗;敲除sfp基因引起了多种NRPS&PKS物质的合成缺陷,Sfp合成缺失的突变体失去了对茄科劳尔氏菌的拮抗活性。进一步对已知的依赖sfp合成的脂肽类拮抗基因dhb、bac,聚酮类拮抗物质合成基因dfn、mln、bae进行敲除,将这些突变体以及实验室构建的脂肽类拮抗基因bamD、fenA、srfA突变体的发酵液对茄科劳尔氏菌进行牛津杯平板对峙试验,发现:脂肽物质surfactin和聚酮类物质difficidin的合成基因缺失突变体降低了对茄科劳尔氏菌的抑菌活性,而其余物质合成基因的缺失突变体并没有降低对茄科劳尔氏菌的抑菌活性。srfA和dfn的双敲除突变体对茄科劳尔氏菌的抑菌活性降低了72.8%,表明surfactin和difficidin参与了土传病原菌茄科劳尔氏菌的拮抗过程,未知活性物质的种类尚待进一步测定。3.使用长期种植番茄的土壤盆栽番茄,设置土壤灭菌/非灭菌两个主处理。土壤中外源添加浓度为1×108 CFU·g-1SQR9-GFP与浓度为1×106 CFU·g-1的GFP荧光标记的SQR9菌体细胞（SQR9-GFP）,不加菌处理作为对照。使用荧光定量PCR的方法,构建功能基因的荧光定量标准曲线,检测番茄根际条件下解淀粉芽孢杆菌SQR9-GFP的生存情况以及脂肽类拮抗基因bam、fen、srf、dhb、bac,聚酮类拮抗物质合成基因dfn、mln、bae基因的转录水平。结果表明:施加浓度为1×108 CFU·g-1菌体的处理SQR9-GFP特异性基因拷贝数在根际环境中表达水平于施入菌体后3-30天内稳定在107-108 copies·g-1干土。施加菌体后的第三天灭菌处理与非灭菌处理相比,SQR9-GFP特异性基因拷贝数在P≤0.5的水平上无显著性差异,而在检测的第7、15和30天灭菌土壤中SQR9-GFP特异性基因拷贝数比非灭菌土壤分别高1.94、2.08和1.85倍;几种功能基因在土壤中的表达水平存在显著的差异。在SQR9-GFP于根际的定殖过程中,srfA基因在土壤中的拷贝数最多,在施入菌体后的第30天,SQR9-GFP的特异性基因拷贝数达109 copies·g-1干土。Dhb作为SQR9基因组中发现的唯一一个铁载体合成基因,在施加1×108 CFU·g-1菌体的处理于根际环境中有高达107-108 copies·g-1干土的稳定表达。试验结果表明:解淀粉芽孢杆菌SQR9在对峙不同病原真菌时使用了不同的拮抗策略;SQR9对茄科劳尔氏菌72.8%的拮抗活性是因surfactin与difficidin的参与;推测surfactin因参与根际定殖、诱导植物抗性等生物活性而在SQR9于番茄根际原位条件下相关合成基因的表达量显著高于其他基因,为SQR9作为一株潜力较大的生防菌提供了有力证据。