毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因PtCP1的克隆及酶学研究

来源 :北京林业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhoukang3201
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半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease)作为一类重要的蛋白酶家族,广泛参与植物的各种生理过程,其与环境胁迫如低温、干旱和盐胁迫以及植物细胞程序性死亡相关。毛果杨(Populus trichocarpa Torr.&Gray)作为全基因测序模式木本植物,选择其作为研究对象,对于半胱氨酸蛋白酶在木本植物中的功能研究有重要意义。本研究通过在毛果杨数据库JGI上检索获得PtCPl (Genbank登录号XM006381559.1)序列,通过对其进行引物设计、PCR扩增得到除去信号肽的表达序列的克隆,构建表达pET-30a载体,将其转化入大肠杆菌(Escherichia coli),诱导表达。通过His-Tag结合Ni-NTA柱的亲和层析方法获得纯化蛋白,再通过复性、酸化等步骤获得体外活性,对其酶学性质进行研究。结果表明,序列分析PtCP1是CP型木瓜蛋白酶,基因CDS序列为1077bp,翻译358个氨基酸,大小为39KDa。切除信号肽序列表达336个氨基酸,37KDa。酸化后约为21kDa,具有半胱氨酸蛋白酶活性,以酪蛋白为底物测定米氏常数Km=32.18±1.66μg/mL,最大反应速度Vm=5105.8±407.3μg/mL/min。在pH3.0、温度37℃时具有最高活性,在pH在2.0-4.0范围、温度在4℃-50℃范围内,PtCP1还能保持最大活性的20%以上。蛋白酶抑制剂leupeptin、PMSF、pepstatinA、E-64、 TLCK、antipain对其抑制效果分别为占对照总活性的20.53%、13.91%、7.28%、3.97%、17.88%、5.96%,其中E-64起到最大抑制效果,证明该酶是木瓜蛋白酶型的半胱氨酸蛋白酶。本研究针对毛果杨PtCP1的体外酶学活性进行分析,对木本植物半胱氨酸蛋白酶家族的功能鉴定,提供了基础,对后续PtCP1的体内生理研究有着重要意义。
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