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重组工程是一种高效的适用于体内遗传工程的方法,能适用于大肠杆菌染色体和游离型复制子,可以在任何位点实现DNA分子的重组修饰而无需受到限制性内切酶位点的制约,通过重组工程很容易获得基因敲除、点突变和基因标签的插入,是大肠杆菌中基因功能研究的主要方法,具有操作简单、周期短、重组效率高等特点。定点突变技术是在已知DNA序列中任意地插入、取代或移除DNA片段,对靶DNA分子引入特异性改变可以快速高效地改善靶蛋白的表达特性,是研究基因工程和蛋白工程的有效的工具。现如今市场上常用的点突变方法有PCR介导的定点突变、寡核苷酸引物介导的定点突变和盒式突变,这些方法存在周期长或成本高的问题。本论文提出一种新的点突变技术,利用PCR引入突变位点,再由重组工程实现突变位点取代目标质粒上的待突变位点。以质粒pLS122为例,对质粒上的nanA基因进行S208G.E192N点突变和E192点饱和突变实验。MMR(Mismatch repair)系统中的mutH, mutL基因编码的蛋白是错配修复系统中的特异性蛋白,修复复制过程中产生的碱基错配,同样的mutT, uvrB和ung基因所编码的蛋白可能会纠正重组时突变位点的错配,影响突变效率,故而本研究尝试敲除以上有关基因来提高重组突变效率。通过敲除mutH、mutL、mutT、uvrB和ung后,突变效率仍为50%,没有显著提高。突变片段5’端磷硫酰修饰可减少菌体内DNA酶对突变片段的降解,以提高重组效率来获得更多正确的突变菌株,然而结果表明突变片段5’端的修饰使得突变效率降低至20%左右。此外,同源重组效率跟同源臂长度有关,因此本研究通过延长突变片段一侧的同源臂长度来提高重组效率,最后发现一侧长同源臂的突变片段和pLS122以1：1的摩尔比共转化重组菌株后,突变效率提高到75%。E192点饱和突变实验仅得到15种其它氨基酸的突变密码子。重组工程介导的基因突变周期短,操作过程简便,如能进一步提高突变效率,则有可能广泛使用于点突变等研究。ccdB基因编码的CcdB蛋白对大肠杆菌有强致死性,该特性使得ccdB基因可用于克隆转化或重组时的筛选标记。含ccdB和R6K复制子的克隆可在E. coliDB3.1 λpir中存在,但在E. coli DB3.1 λpir中以R6K为复制子的克隆为低拷贝,并且转化效率较低,.不利于作为以R6K为复制子的克隆的转化宿主菌株。因而本研究从E. coli BUN20出发,将E. coli BUN20的GyrA蛋白的第462位精氨酸突变为半胱氨酸,得到一种新型的可容纳ccdB的E. coli BUN20的GyrA462突变菌株,LS027,该GyrA462突变菌株可以有效地抵抗CcdB的毒性,经验证转化效率约6.9×108/μg,比E. coli DB3.1 Xpir的转化效率提高了100倍,同时因为含有pir的突变体pir116基因,R6K质粒表现为高拷贝,.克隆拷贝数增加至每细胞200个,这种能更好地容纳ccdB基因的新型菌株将会普遍应用于ccdB相关的克隆构建中。