论文部分内容阅读
目的：生产新的柚皮苷单克隆抗体,对其进行一系列的应用探索,建立柚皮苷的酶联免疫吸附法,制备柚皮苷免疫亲和层析柱,并利用新抗体和原有抗体进行双抗夹心ELISA的探索。方法：复苏杂交瘤细胞库中的能产生柚皮苷单克隆抗体的杂交瘤细胞,制备新的柚皮苷单克隆抗体；利用该单抗与凝胶偶联制备免疫亲和层析柱,用于敲除柚皮苷；利用新柚皮苷单抗与原有的柚皮苷单抗,进行双抗夹心酶联免疫吸附法的探索。1.复苏柚皮苷单克隆抗体杂交瘤细胞,制备新的柚皮苷单克隆抗体。2.优化包被原稀释液的选择、优化包被原包被浓度、优化一抗工作浓度及考察线性检测范围,常规间接竞争酶联免疫分析建立柚皮苷的酶联免疫吸附法。并考察其精密度及加样回收率,进行中药复方中柚皮苷含量的测定。3.利用本课题制备的柚皮苷单克隆抗体,经琼脂糖凝胶活化、抗体偶联、封闭、洗杂、平衡后,装柱,制备柚皮苷免疫亲和层析柱。考察抗体凝胶偶联率、偶联比、柱容量,评价已制备的柚皮苷免疫亲和层析柱。4.利用柚皮苷的两种单克隆抗体进行双抗夹心酶联免疫吸附法的探索,通过考察包被原稀释浓度、一抗稀释浓度、二抗稀释浓度等条件对其显色的影响,来优化其反应的条件,制作双抗夹心曲线,考察其精密度。结果：新的柚皮苷单克隆抗体与原有的柚皮苷单抗在交叉反应、线性范围、抗体亚型方面等有差别,所建立的柚皮苷酶联免疫吸附法性能稳定、精密度、回收率均符合要求,柚皮苷单抗的免疫亲和层析柱能够敲除柚皮苷,可用于柚皮苷药理药效的研究,双抗夹心酶联免疫吸附法已有初步进展。1.所生产的新的柚皮苷抗体特异性强,除与芦丁与野黄芩苷有轻微的交叉反应外,与其余结构类似物均无明显交叉反应(<0.1%)；其亚型为IgG2b,与已经存在的柚皮苷抗体的亚型(IgG1)不同,这是这两种抗体可以用于双抗夹心酶联免疫吸附法的必要条件之一。2.利用该新柚皮苷单抗成功建立了酶联免疫吸附法,包被原为1万倍稀释,抗体为64000倍稀释,线性竞争范围为4.883-3125 ng/mL。其y=-0.11n(x)+0.0146,R2=0.9945,精密度良好,孔间差<5%,板间差小于10%,平均加样回收率为103.1%,可以用于样品检测。3.制备了柚皮苷免疫亲和层析柱,抗体偶偶联率为99.12%,偶联比为2.938μg/mL柱容量为51.26μg。4.初步探索了双抗夹心酶联免疫吸附法,优化条件发现其最优条件为包被稀释12800倍,一抗稀释5000倍,二抗稀释2000倍,并在此条件下制备出了标准曲线,其线性范围为200μg/mL-1200μg/mL,精密度良好,为深入研究天然化合物柚皮苷的双抗夹心酶联免疫吸附法提供了一点线索。结论：制备出了一种新的柚皮苷单克隆抗体,这种新的抗体与原有的抗体性能结构方面有差异,利用这种新的柚皮苷抗体制备的亲和层析柱能够成功敲除柚皮苷,利用这种新的柚皮苷单抗与原有的柚皮苷单抗可以成功建立双抗夹心法。