论文部分内容阅读
赭曲霉毒素A（OchratoxinA,OTA）是曲霉素和青霉素产生的真菌毒素,广泛存在于污染的食品和饲料中,严重威胁人类及动物健康。现已证实OTA对多种组织器官均有毒性作用,但主要靶器官为肾脏。当前对OTA肾毒性作用的机制主要围绕细胞凋亡及氧化应激等相关方向研究。有研究表明,OTA通过介导细胞凋亡、产生活性氧（ROS）并干扰抗氧化酶合成进而发挥其毒性作用。细胞焦亡是细胞的一种炎性程序性死亡方式,是当前研究最热门的方向之一;目前对于细胞焦亡是否参与OTA诱导的肾毒性尚无研究。鉴于OTA的广泛性和危害性,人们亟需寻找安全有效的缓解方法;而营养调控作为安全、方便、副作用少的新技术,越来越受到广泛关注。硒是机体必需的微量元素之一,具有多重生物学功能,包括抗氧化、拮抗有毒元素等。据报道,硒主要是通过硒蛋白的形式发挥其生物学功能。锌同样是机体所必需的微量元素,作为细胞中多种酶和转录因子的辅助因子,广泛参与细胞抗氧化及DNA稳定性的调节。虽然目前已有一些文献报道了微量元素在霉菌毒素中的生物学功能,但关于微量元素参与缓解OTA毒性的作用及其机制尚未明确。本研究重点以犬肾细胞及动物模型中肾脏组织作为研究对象,探索OTA诱导肾损伤的机制及硒/锌对其的保护作用。试验一:OTA通过NLRP3炎性小体和Caspase-1介导的细胞焦亡诱导肾毒性本试验的研究目是通过体内和体外试验探究OTA暴露诱导肾毒性的潜在机制。在体内试验中,小鼠每隔一天腹腔注射不同剂量的OTA（1.0 mg/kg·d-1,2.0mg/kg-d-1）,持续14天。结果发现,与对照组相比,2.0 mg/kg·d-1的OTA造成小鼠肾脏组织学损伤并显著上调了肾纤维化基因（α-SMA、Vimentin和TGF-β）的表达（P<0.05）;OTA暴露激活了肾脏NLRP3炎性小体并诱发了细胞焦亡。体外试验以Madin-Darby犬肾（MDCK）上皮细胞为模型,通过不同浓度OTA处理发现,OTA以剂量依赖性方式引起细胞毒性,并显著上调了肾纤维化基因（α-SMA、Vimentin和TGF-β）的表达（P<0.05）;与对照组相比,2.0 μg/ml OTA处理可显著引起NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体的活化和Caspase-1依赖性焦亡（P<0.05）,从而促进MDCK细胞中促炎性细胞因子（IL-6、TNF-α）的分泌及焦亡相关基因（GSDMD、IL-1β、IL-18）的表达;通过添加NLRP3抑制剂或特异性siRNA可以显著抑制由焦亡介导的肾纤维化（P<0.05）;此外,敲低Caspase-1也缓解了由焦亡介导的肾纤维化。该试验结果表明,OTA通过激活NLRP3炎性小体和Caspase-1依赖的焦亡途径在体内外诱发肾毒性,该发现为阐明OTA诱导的肾毒性提供了新的见解。试验二:硒对OTA诱导犬肾毒性的缓解作用及其机制研究我们已证实了 OTA可通过激活NLRP3炎性小体和Caspase-1依赖的焦亡途径在体内外诱发肾毒性。为了研究SeMet对OTA引起的肾毒性的保护作用,本试验以MDCK细胞为模型,测定了细胞活力、LDH活性及肾纤维化、NLRP3炎性小体和焦亡相关基因的表达。MTT和LDH活性检测结果表明,一定浓度的SeMet可以显著抑制2.0μg/ml OTA诱导的MDCK细胞毒性（P<0.05）。通过荧光定量PCR试验结果发现,8 μM SeMet能够极显著下调OTA诱导的肾纤维化相关基因（α-SMA、Vimentin、TGF-β）的mRNA表达（P<0.01）;同时,OTA诱导的NLRP3炎性小体（NLRP3、ASC、Caspase-1）和细胞焦亡相关基因（GSDMD、IL-1β、IL-18）的上调也被8 μM的SeMet极显著抑制（P<0.01）。本试验结果表明,SeMet可缓解OTA诱导的肾毒性,并能够抑制NLRP3炎性小体和Caspase-1介导的细胞焦亡。因此,SeMet可作为缓解OTA引起肾脏损伤的一种有效手段。试验三:锌对OTA诱导犬肾细胞氧化应激和凋亡的缓解作用及其机制研究本试验研究目的是探究锌对OTA诱导的MDCK上皮细胞氧化应激和凋亡的保护作用,并探究其潜在的机制。MTT和LDH活性的试验结果表明,一定浓度的锌能显著抑制OTA诱导的MDCK细胞毒性（P<0.05）;激光共聚焦显微镜观察显示,锌的添加减轻了 OTA诱导的活性氧（ROS）积累（P<0.05）;流式细胞术及荧光染色结果显示,锌的添加能够显著缓解OTA诱导的细胞凋亡（P<0.05）。对锌相关蛋白的研究发现,与对照组相比,OTA单独处理显著增加了 MDCK细胞中金属硫蛋白-1（MT-1）和金属硫蛋白-2（MT-2）的表达（P<0.05）,而锌添加后会进一步增强OTA诱导的MT-1和MT-2的表达（P<0.05）;当MT-1和MT-2被双重敲低后,锌的添加对OTA诱导的ROS积累和凋亡的抑制作用被明显阻断（P<0.05）,证实了 MT-1和MT-2对OTA诱导的细胞毒性、氧化应激和凋亡起适应性保护作用。本试验结果表明,OTA可以诱导MDCK的细胞毒性、氧化应激和凋亡,补锌可以通过上调MDCK细胞中MTs的表达来减弱OTA诱导的ROS产生和凋亡,进而起到缓解OTA肾毒性的作用。