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诺如病毒(Norovirus,NoV)是引起全球急性胃肠炎的主要致病原,全年均可感染,主要感染儿童、老人和免疫力低下人群。诺如病毒可以食物和水源为载体导致人类患病,又被称作食源性病毒(Foodborne Virus)和水源性病毒(Waterborne Virus)。食源性病毒和水源性病毒主要通过粪-口途径传播,因其传染性强和传播速度快等特征,成为严重威胁人民群众的健康和生命安全,甚至影响社会稳定的重大因素。在食源性病毒和水源性病毒引起的食品安全事故或突发公共卫生事件中,诺如病毒占据了重要地位。由于食品种和水源的种类繁多,成分复杂,污染的病毒含量低,病毒分布不均一,且含有各种抑制病毒检测的因子等因素,使得食源性病毒和水源性病毒检测成为全球公共卫生面临的重点和难点。我国已建立了全国病毒性腹泻监测网络,具备了完整的引起腹泻病毒病相关病毒的检测技术体系。但我国建立食源性病毒和水源性病毒检测体系起步晚,体系还不完善。目前我国仅发布了食品(硬质表面食品、软质水果、生食蔬菜和贝类消化腺)中诺如病毒检测的食品安全国家标准(GB 4789.42-2016),该标准是在欧盟的ISO/TS 15216-2的基础上建立,并没有进行检测方法优化。并且该国标也不包括脂肪、蛋白类即时食品中和水中诺如病毒检测方法。而在欧盟的ISO/TS 15216-2中也是仅有瓶装水中诺如病毒的检测,缺少大量水中诺如病毒的检测方法。但是目前大部分水源性病毒的暴发均与现场水源(地表水、地下水和自来水)有关,而为了能检测到现场水源中低浓度和分布不均的病毒粒子,需要建立适宜的方法来开展现场采样和提高病毒检测的灵敏度。本研究旨在对已有的临床样本中诺如病毒核酸检测方法进行实验室评价和应用;通过建立水和食品中诺如病毒检测方法与形成水和食品中病毒检测方法的操作规范,为我国水源性和食源性病毒病的检测、监测和应对提供了可借鉴的标准化实验室检测技术。一、临床样本中诺如病毒检测方法的实验室评价和应用实验室评价已发表的诺如病毒GI、GII基因型多重荧光定量反转录聚合酶链反应(Realtime RT-PCR)检测方法,应用该方法对内蒙古呼和浩特市2012年-2017年1863份住院儿童急性胃肠炎粪便样本进行诺如病毒检测。结果显示在1863份住院儿童粪便样本中,诺如病毒阳性率24.25%(12.78-32.92%),诺如病毒全年感染,冬季为感染高峰期。获得306条诺如病毒VP1区基因序列,包括6个基因型:GII.3(71.24%),GII.4(23.53%),GII.2,GII.5,GII.6,和GII.13。诺如病毒聚合酶区序列分析显示GII.P12/GII.3、GII.Pe/GII.4和GII.P4/GII.4是主要流行基因型。二、水中诺如病毒检测方法的建立与应用以鼠诺如病毒(Murine Norovirus-1,MNV-1)作为模式病毒和过程对照病毒,结合膜吸附洗脱富集技术(viral adsoption-elution,VIRADEL)和 Realtime RT-PCR,按照采集水的体积及采样方式的不同建立和评估了两种不同的水源性诺如病毒富集方法。结果显示(1)瓶装、桶装水采用阴或阳离子膜吸附法进行病毒初次浓缩,病毒滞留率分别可以达到99.92%和98.23%;无论是阴离子膜还是阳离子膜,1%Tralk洗液洗脱效果最佳;超滤法对洗脱液进行二次浓缩,最终将待检水样浓缩至200μL;该检测体系能在10个小时内较好地完成0.1mL-5L水中诺如病毒和甲肝病毒的浓缩和检测,并且诺如病毒和甲肝病毒的回收率分别为15.25%和6.76%。最后该方法通过了三家实验室的验证。(2)自主研发了一种适合野外现场采样的病毒采集系统(Biotroy半自动微生物采集系统)。该系统能在野外现场无外电源的条件下2个小时内完成1000L环境水的采集(水流速10L/min);仅需将过滤完水样的Nanoceram膜装置低温带回实验室,用Tralk洗液洗脱病毒,再通过PEG-6000沉淀和超滤二次浓缩最终获得了 1mL浓缩水样,并且Tralk洗液对Nanoceram膜的MNV-1洗脱率达到70.45%。(3)对北京市昌平区京密水渠饮用水进行了病毒富集,通过高通量测序和病毒宏基因组分析了该饮用水的病毒谱,发现了 5个病毒科的哺乳动物病毒谱,其中一些与人类疾病相关,包括通过粪口途径传播的主要常见病毒如诺如病毒(NoV GII.17)、肠道病毒(Enterovirus 71,EV 71)、甲肝病毒(HAV)和爱知病毒(Aichivirus,Aichi1)。本研究建立了适合实验室的瓶装、桶装水中诺如病毒富集检测方法和适合野外现场的大量水中诺如病毒的富集和检测方法,并应用自主研发的Biotroy半自动微生物采集系统对我国北京市昌平区京密水渠开展了饮用水中病毒的富集和检测。三、食品中诺如病毒检测方法的优化与评估以MNV-1为模式病毒和过程对照病毒,结合Realtime RT-PCR检测方法,优化和评估了软浆果、碳水化合物类食品及蛋白质、脂肪类即食食品中诺如病毒的检测方法。(1)考察Tralk洗液、TGBE洗液、TPB洗液和NaPP洗液对软浆果(草莓和葡萄)和碳水化合物类食品(生菜和洋葱)中MNV-1的洗脱效果,比较洗脱液的二次浓缩方法PEG6000沉淀和超滤对MNV-1的浓缩效果。评估优化后方法对不同食品中诺如病毒的富集效果。结果表明软浆果草莓中TGBE洗液-PEG6000沉淀组合方法的MNV-1回收效果优于其他组合,诺如病毒检测限为103基因拷贝/10g;葡萄中TGBE洗液-超滤的MNV-1回收效果优于其他组合,诺如病毒检测限为104基因拷贝/10g;生菜中Tralk洗液-PEG沉淀的MNV-1回收效果优于其他组合,诺如病毒检测限为103基因拷贝/10g;洋葱中Tralk洗液-超滤的MNV-1回收效果优于其他组合,诺如病毒检测限为104基因拷贝/10g。(2)比较了洗脱-浓缩方法和直接RNA提取法回收蛋糕和午餐肉中MNV-1的回收效果,结果显示前者没有检测到蛋糕和午餐肉的MNV-1,后者成功回收到了 MNV-1,但是诺如病毒的检测限高于其他种类食品,分别为106基因拷贝/10g和104基因拷贝/10g。本研究建立了软浆果、碳水化合物类食品和脂肪蛋白类即食食品中诺如病毒的检测方法。优化和完善了我国食品中诺如病毒检测体系。四、贝类中病毒的检测以MNV-1为模式病毒和过程对照病毒,结合Realtime RT-PCR检测方法,初步探讨了贝类中诺如病毒两种不同检测方法的检测效果。(1)比较蛋白酶K结合PEG沉淀和蛋白酶K结合直接RNA提取两种贝类中诺如病毒检测效果。用蛋白酶K结合PEG沉淀得到的MNV-1回收效果优于蛋白酶K结合直接RNA提取方法获得的MNV-1回收效果。(2)收集我国北京市330份贝类样本,蛋白酶K结合PEG沉淀处理贝类消化腺和肠道后,利用高通量测序和病毒宏基因组分析获得贝类中的病毒谱。本研究通过高通量测序后共获得了 4594270条被注释病毒的基因序列,其中以动物为宿主的病毒序列占21%(965185/4594270)。而在以动物为宿主的病毒序列中,被注释到哺乳动物为宿主的病毒序列占1.26%(12205/965185),包括20个病毒科,其中就有小RNA病毒科(Picornaviridae)的12个病毒属和杯状病毒(Caliciviridae)的诺如病毒属(Norovirus)和札如病毒属(Sapovirus),包括常见的人疾病暴发相关的EV、HAV 和 NoV,其中 NoV 的基因型包括 GII.1、GII.2、GII.13、GII.14 和GII.17。NoV GII.2基因序列与目前我国NoV主要流行株的氨基酸同源性达到100%,而GII.17与流行株的氨基酸同源性为98%。总之,实验室评价了已发表诺如病毒Realtime RT-PCR检测方法,通过该方法获得了 2012年-2017年内蒙古呼和浩特市5岁以下住院儿童诺如病毒的分子流行特征。本研究自主研发了一套适合现场水样采集的Biotroy半自动微生物采集系统,建立了水和食品中诺如病毒的回收检测方法,形成了水和食品中诺如病毒检测方法操作规范,并结合病毒宏基因组学方法初步探讨了饮用水源和贝类中的病毒谱。