长链非编码RNA-HRIM通过自噬通路调控心肌缺血再灌注损伤的初步研究

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背景:冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)是心血管最常见疾病,急性心肌梗死是人类致死的主要原因之一。再灌注治疗可以挽救濒临死亡的心肌,但同时会导致另一种损伤---缺血再灌注损伤。如何心肌缺血再灌注损伤程度,改善病人的预后已成为当前心血管疾病领域的一个重要课题。缺血再灌注造成心肌细胞损伤的机制尚未完全阐明。一般认为,在心肌缺血再灌注损伤中导致心肌细胞死亡的形式只有凋亡和坏死两种形式,近年研究证实心肌细胞内存在第三种机制调控心肌细胞的存活或死亡,即自噬作用。它与凋亡类似,通过启动细胞内部信号通路,形成级联式信息传导和相应基因表达,诱导细胞死亡。最近的研究显示异常表达的长链非编码RNA(long noncoding RNAs,lncRNAs)在多种疾病过程中扮演着重要的角色,这为心肌缺血再灌注机制的研究又增添了一个切入点。  目的:分析心肌缺血再灌注过程中差异性表达的lncRNAs,寻找与心肌缺血再灌注损伤相关的lncRNAs,探讨lncRNA调控心肌缺血再灌注的机制并为心肌缺血再灌注损伤的治疗提供新的靶点。  方法:  第一部分:lncRNAs在心肌缺血再灌注中的差异性表达及目的lncRNAs的挑选利用心肌细胞经过缺氧再复氧处理模拟临床上心肌缺血再灌注损伤后做基因芯片,建立心肌缺血再灌注过程中差异性表达的lncRNAs谱和mRNAs谱(差异倍数>1.5倍,P<0.05)。我们利用一系列的生物信息学分析包括GO分析,Pathway分析针对心肌缺血再灌注损伤的机制确定研究方向,由于lncRNAs存在多种调控方式,因此根据lncRNAs通过调节mRNAs的表达发挥作用,对lncNRA的靶基因进行预测,根据lncRNAs可以通过调节相关蛋白发挥相应的作用,我们构建lncRNA与mRNA的共表达网络,从而最终确定目的lncRNAs。  第二部分:lncRNAs-HRIM对心肌细胞缺氧再复氧损伤影响的研究构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型(细胞水平)和langendorff离体心脏缺血再灌注模型(整体水平),采用qRT-PCR检测目的基因lncRNAs的表达情况。用RNAi技术对lncRNAs-HRIM进行干扰,观察lncRNAs对细胞活性的影响,利用Western blot检测自噬蛋白LC3B的表达,透射电镜观察细胞自噬小体的数目,观察自噬活性的改变情况以及采用自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)追踪自噬流。  结果:  第一部分:基因芯片结果显示常氧组心肌细胞和缺氧再复氧组心肌细胞之间存在大量差异表达的基因,包括797条lncRNAs和1898条mRNAs。其中许多与低氧或自噬相关的分子均高表达。一系列的生物信息学分析包括GO分析、pathway分析、trans/cis靶基因预测以及lncRNAs与mRNAs共表达分析提示心肌缺氧再复氧过程与细胞凋亡和自噬有关,并从中挑取6条表达上调的lncRNAs(NR_002154;lnc-RNA1,lnc-RNA2,lnc-RNA3,lnc-RNA4,lnc-RNA5)和2条表达下调的lncRNAs(lnc-RNA6,lnc-RNA7),并将其中一条表达上调的lncRNA-NR_002154定义为心肌缺氧再复氧损伤相关的lncRNA(LncRNAAssociated with Hypoxia Reoxygenation Injury in Myocardial cell,lcnRNA-HRIM)。  第二部分:从细胞水平和整体水平,通过qRT-PCR实验结果显示6条lncRNAs(NR_002154; lnc-RNA1,lnc-RNA2,lnc-RNA3,lnc-RNA4,lnc-RNA5)表达发生下调和2条lncRNAs(lnc-RNA6,lnc-RNA7)表达发生下调,与基因芯片结果相符。RNAi结果显示,在心肌细胞中缺氧再复氧过程中,随着lncRNA-HRIM的表达的降低,细胞活性明显增加,自噬的活性下降。  结论:  1.心肌在缺氧再复氧过程中具有特异的lncRNAs表达谱。  2.lncRNA-HRIM在心肌缺血再灌注损伤中参加自噬通路的调控,继而影响细胞活性。
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