论文部分内容阅读
目的:越来越多的研究表明维生素D除了在维持体内钙磷的稳态和调节骨代谢中发挥重要作用外,在生殖系统中也具有重要作用。一些研究显示体内血液维生素D缺乏与男性的生殖功能下降和生育能力降低相关,但是结论存在不一致,并且有一些研究显示血液中维生素D浓度过高时亦可能会造成精子活力降低和浓度降低。精原干细胞是男性生殖功能的种子细胞,但是维生素D对精原干细胞的具体作用,至今少见报道。本研究首先旨在研究维生素D异常对精原干细胞增殖和凋亡等细胞命运的影响和机制,其次研究维生素D异常时对雄鼠精子发生的影响和机制。方法:细胞实验部分:1.体外培养小鼠精原干细胞(C18-4),采用qRT-PCR和免疫荧光染色法鉴定细胞。2.采用CCK-8法检测不同浓度、不同作用时间1α,25-(OH)2D3处理对C18-4细胞活力和增殖的影响。3.采用流式细胞仪(Annexin V/PI染色)检测10-7M浓度1α,25-(OH)2D3处理对C18-4细胞凋亡的影响。4.采用qRT-PCR方法检测10-7M浓度1α,25-(OH)2D3处理对C18-4细胞Bcl-2、Bax、Vdr和Pcna基因表达的影响。动物实验部分:1.动物模型的建立:将SD雄性大鼠随机分为两组:(1)低维生素D(VDI)组(n=5)给予低维生素D饮食喂养14周;(2)正常饮食(VD)组(n=7)给予正常含量维生素D饮食喂养14周。平均两周记录一次大鼠体重,喂养第14周后集体处死,并记录身长、体重和左右睾丸重量。2.大鼠血清指标的检测:采取腹主动脉采血的方法,收集后分离血清,采用全自动生化分析仪测定维生素D(25(OH)D)、血清钙、血清碱性磷酸酶和血清磷。3.大鼠附睾精子密度测定:取大鼠附睾制备精子悬液并计数。4.大鼠睾丸切片制作和染色:取大鼠睾丸组织石蜡包埋后制作切片,予以H&E染色和PCNA免疫组织化学染色。统计学方法:采用SPSS 20.0统计软件包进行分析,以均数±标准差(Mean±SD)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,如果方差齐则采用LSD法,如果方差不齐,则采用Dunnett’s T3法。P<0.05为差异有统计学意义。结果:细胞实验部分:1.细胞鉴定结果:经鉴定C18-4细胞为小鼠精原干细胞。2.CCK-8法检测结果:与对照组相比较,10-7M浓度1α,25-(OH)2D3处理24h和48h后A450值显著降低(P<0.05)。3.流式细胞仪检测结果:与对照组相比较,10-7M浓度1α,25-(OH)2D3处理48h后,早期细胞的凋亡比例显著增高(P<0.05)。4.qRT-PCR检测结果:与对照组相比较,10-7M浓度1α,25-(OH)2D3处理48h后,Bax基因和Vdr基因表达显著上调(P<0.05),而Bcl-2基因和Pcna基因表达显著下调(P<0.05)动物实验部分:1.大鼠生理指标测定结果:与VD组比较,VDI组体重,身长和左右侧睾丸重量的差异均无统计学意义(P<0.05)。2.血清学检测结果:与VD组比较,VDI组血清25(OH)D水平明显降低(P<0.01),血清碱性磷酸酶含量明显下降(P<0.05)。3.附睾精子密度检测结果:与VD组比较,VDI组附睾精子密度下降但无统计学差异(P<0.05)。4.H&E染色睾丸形态分析结果:与VD组比较,VDI组睾丸细胞切片中有少许空泡、细胞脱落和无精子的现象,但两组差异无统计学意义(P<0.05)。5.睾丸PCNA免疫组织化学染色结果:两组间PCNA蛋白表达的差异无统计学意义(P<0.05)。结论:1.较高浓度1α,25-(OH)2D3通过抑制Pcna的表达而抑制小鼠精原干细胞的增殖;通过上调Bax和下调Bcl基因表达而促进小鼠精原干细胞的凋亡。2.大鼠低维生素D饮食导致附睾精子密度趋势下降。