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研究目的:目前已有多项研究证实中药银莲花的提取物竹节香附素A(RaddeaninA,RA)能够有效地抑制肝癌、卵巢癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤细胞株的增殖,且本课题组在前期体外实验中也证实RA能够很好的抑制高、中、低不同分化程度的胃癌细胞的增殖,但未能观察RA的体内抗肿瘤作用。本实验拟研究RA在体内外对肠癌HCT116细胞自噬和凋亡的影响,并进一步讨论其相关机制,为大肠癌更好地治疗提供更多的理论依据。研究方法:体外实验研究方法1通过MTT实验检测不同浓度的RA(2、4、8、16 μM)对HCT116细胞不同作用时间(12 h、24 h、36 h、48 h)的增殖抑制作用。2倒置相差显微镜观察RA对HCT116细胞形态变化的影响。3 透射电镜(Electron Microscope Analysis,TEM)观察 RA 作用于 HCT116 细胞后自噬体的形成情况。4 Hoechst33258 染色及流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)观察 RA 对 HCT116 细胞凋亡的影响。5 RealTime-PCR(RT-PCR)检测 RA 对 HCT116 细胞自噬、凋亡及 PI3K/AKT/mTOR通路等相关基因表达的影响。6采用免疫荧光实验检测RA对HCT116细胞自噬相关蛋白LC3表达的影响。7 采用 WesternBlot(WB)实验检测 RA 对 HCT116 自噬、凋亡、PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响。8应用PI3K抑制剂LY294002阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路,分别观察RA对HCT116细胞自噬和凋亡的影响。9分别应用自噬抑制剂羟氯喹(Hydroxychloroquine,HCQ)和自噬激动剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA),观察RA对HCT116细胞自噬和凋亡关系的影响。体内实验研究方法1采用人肠癌HCT116细胞建立荷瘤鼠模型,分为对照组和RA组,隔天一次腹腔注射给药,观察RA对裸鼠皮下移植瘤生长情况的影响。2采用HE(hematoxylin-eosinstaining)染色法观察RA对裸鼠移植瘤组织形态学变化的影响。3透射电镜观察RA对裸鼠移植瘤组织自噬的影响。4 TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)染色法观察 RA 对裸鼠移植瘤细胞凋亡的影响。5Westrn Blot实验、免疫组织化学实验分别检测自噬、凋亡和PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达情况。研究结果:体外研究结果1MTT实验显示,同一时间,随着浓度的增大(2、4、8、16μM),RA对HCT116细胞的增殖抑制作用逐渐增加,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01);同一浓度的RA分别作用于HCT116细胞12 h、24 h、36 h、48 h,抑制率随作用时间的延长而增加,RA对HCT116细胞的增殖抑制作用表现为良好的浓度、时间依赖性。2观察RA作用于HCT116细胞后形态的变化,镜下可见:对照组细胞生长状态良好,细胞间连接紧密,排列规则,细胞形态清晰可见,而经RA处理过的细胞状态较差,数量逐渐减少,细胞形态变圆皱缩,细胞间间隙也逐渐增大,且随着RA浓度的增大,细胞基本失去原有形态,甚至出现漂浮细胞。3透射电镜显示,对照组胞质内未发现自噬体相关结构,而经RA(4 μM)处理过的HCT116细胞在胞质内可见清晰的双层膜自噬体结构。4经不同浓度RA(4、8μM)处理后,Hoechst33258染色观察到HCT116细胞核逐渐出现固缩、碎裂现象;流式细胞术结果显示:与对照组相比,随着RA浓度的增大,早期凋亡和中晚期凋亡细胞数逐渐增多,凋亡呈现量-效关系。5RT-PCR实验结果显示,RA作用于HCT116细胞12h后,自噬相关基因Beclin-1、ATG5、ATG12表达较对照组均增高;促凋亡BAX基因表达上调,而抑凋亡Bcl-2基因表达下调。6免疫荧光实验结果显示,4μM的RA作用于HCT116细胞后,自噬相关蛋白LC3表达较对照组显著增加。7 RA处理HCT116细胞12 h后,Western Blot实验结果发现,自噬相关蛋白Beclin-1、ATG5、ATG12的表达随着RA浓度的增大而增加,LC3 Ⅰ蛋白的表达也随着浓度的增大逐渐向LC3Ⅱ蛋白翻转;凋亡关键性蛋白Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP表达较对照组显著增加,不仅如此,凋亡内源性通路和外源性通路关键蛋白Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-8 表达也增加。而 PI3K/AKT/mTOR 信号通路相关蛋白 p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达则随着RA浓度的增大而减少。8 RA(4 μM)联合 PI3K 抑制剂 LY294002(10μM)作用于 HCT116 细胞后,Western Blot结果显示自噬蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1表达较RA单独作用组增多;流式细胞术(FCM)结果发现RA联合LY294002组细胞凋亡率较RA单独作用组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。此外,RA 联合 LY294002 组凋亡蛋白 Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP表达也增加。9RA(4μM)联合自噬抑制剂羟氯喹(10μM)后,自噬过程被抑制,自噬蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1表达减少,而细胞凋亡率较RA单独作用时也减少,此外,凋亡相关蛋白BAX、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP表达也减少。RA联合自噬激动剂雷帕霉素(100nM)后,LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表达增加,细胞凋亡率较RA单独作用时增加,凋亡相关蛋白BAX、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP 表达也增加。体内研究结果1裸鼠移植瘤实验结果显示,与对照组相比,RA治疗组裸鼠皮下移植瘤无论是瘤体积还是瘤重量都显著减小,差异有统计学意义。2 HE染色结果显示RA(4 mg/kg)组肿瘤组织中有大量炎性细胞浸润,可见病理性核分裂,坏死面积超过1/2,而对照组可见少量炎性细胞,坏死面积不足1/4。3组织电镜镜下观察到RA治疗组组织细胞内有双层膜自噬体结构形成。4 TUNEL染色实验发现对照组未发现被染的凋亡细胞,而RA治疗组出现大量被染色的凋亡细胞。5与对照组相比,Western Blot及免疫组化结果提示RA组中自噬蛋白LC3、Beclin-1表达增加;凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP表达也增加,而caspase-3、PARP表达减少;PI3K/AKT/mTOR通路蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达减少。研究结论:1 RA能够有效地抑制肠癌HCT116细胞的增殖,且呈浓度-时间依赖性。2 RA在体外能够诱导肠癌HCT116细胞发生自噬和凋亡,其机制可能是通过调节PI3K/AKT/mTOR通路实现的。3 RA诱导的HCT116细胞自噬能够增加细胞凋亡。4 RA对肠癌HCT116细胞裸鼠皮下移植瘤的生长具有良好的抑制作用。5诱导细胞自噬和凋亡,可能是RA在体内抑制肿瘤细胞增殖的机制。