同种骨材料具有丰富的来源，且因其具有天然结构、形状和强度，有一定的诱导活性，在骨移植中有其不可替代的地位。冷冻、冻干和脱钙同种骨均已应用于临床，包括骨腔充填、骨段移植术、关节融合术和假体重建术等诸多方面。例如脱钙骨，经化学灭菌、提取抗原和自溶消化处理后，其可溶性同种抗原得到消除，植入受体后，新骨形成远较运用新鲜骨、冻干全骨或Co 60辐照灭菌的冻干骨时为多。在骨移植后的骨折愈合过程中，包括了骨祖细胞的趋化、增殖、分化以及合成细胞外基质的多个组织学进程。自细胞、血管以及骨基质的损伤开始，最终至彻底重新塑形且无瘢痕形成，新骨形成是相关细胞和细胞外基质相互作用的连续变化过程。通过多年的研究，目前，骨折愈合的组织学过程和特征已得到明确阐述，但分子水平的调控机制方面仍有待进一步明确。国内外研究者采用免疫组织化学、逆转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)、原位杂交等方法，检测了骨形成相关发生蛋白-2(Bone Morphogenetic Protein-2，BMP-2)及血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、肿瘤生长因子-β(Tumor Growth Factor-β，TGF-β)在骨折愈合过程中的内源性表达，考核了多种因子在骨折愈合中的诱导成骨作用，表明上述骨形成因子是骨折愈合过程中的关键物质。对于骨折区域的新生骨发育相关细胞，多种生长因子可以促进其增殖、分化以及细胞外基质合成，对骨折修复的启动、发展、调控及改建起重要作用。鉴于此，应用生长因子促进骨折愈合可能取得良好的疗效，研究者们也开展了广泛的基础研究，在此基础上的一系列动物实验和临床应用结果也表明，生长因子类物质用于骨折延迟连接或骨不连的治疗确有良好效果。虽然骨折愈合的分子调控中有许多生长因子参与，但目前只对少数几种的作用机制有所了解，其中研究较为透彻的是骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)家族、TGF-β以及VEGF等。上述几种骨形成相关因子由炎症细胞、成骨细胞和软骨细胞合成，在骨折愈合全过程持续表达，因此对于骨愈合的进程以及骨移植的效果评价具有客观性。本研究主要对同种异体骨移植及自体骨移植后的愈合过程中BMP-2、VEGF及TGF-β的表达情况进行定量考察及变化趋势分析，以选择可能存在的合适的术后时间段，保证以上三种生长因子的分泌表达都处于上升期甚至达到峰值，为术后干预提供参考。在以往的研究中，人们多是对单一运用的细胞因子与骨修复的关系进行评价和考核，结果确切，但却未曾考虑到多种因子可能存在强烈的协同或拮抗作用。为了使试验接近机体内部的真实进程，我们对三种因子的表达情况、变化趋势同时进行考核，并且探讨之间可能的相互关系，为多因子联合应用于骨修复的临床方案提供可能的理论依据。此外，本研究还对同种异体骨和自体骨移植相同时间区段内的内源性相关生长因子表达进行比较，从分泌生长因子的角度评判同种异体骨和自体骨移植的区别，为选择更能促进骨再生的骨移植材料来源提供佐证。尽管在骨移植后，机体的骨形成机理已经得到较完整的阐述，但本研究考察的多种因子的持续表达也是一个动态的变化和非直观化的过程，其评价难以简单地量化。应用光镜进行观察属于较简单和直接的方式，但是只能起到定性的判断，而且其判断受操作者的主观因素、观察区域及实验仪器的客观因素的影响较大，难以进行标准化和规范化。而免疫组织化学染色、放射骨显影定量评价、生物力学分析以及RT-PCR等手段的应用，可以达到较精细程度的考量，为移植骨区域骨再生的量化评判提供了多种选择：(1)免疫组织化学染色：上世纪90年放代以来，金岩和张子军等人利用免疫组织化学方法，对骨折区域的BMP-2表达进行了定量和定位研究，发现了BMP-2的分泌表达存在一定的时间依赖性，得到了其变化趋势，同时还证实了骨缺损区存在的BMP-2浓度梯度，为BMP-2的表达研究奠定了基础。近年来，还有人应用原位杂交技术证明了BMP-2的mRNA表达规律与蛋白的表达相一致，提示BMP-2表达情况的研究将会为开发内源性BMP-2在临床中的应用提供广阔的前景。(2)放射骨显影定量评价：骨骼的主要无机盐成份是羟基磷灰石晶体，其结构类似离子交换柱，具有很大表面积，通过化学吸附和离子交换从血液中获取磷酸盐和其它元素来完成代谢更新。骨移植后，待软组织损伤反应减退，局部骨显像若见移植骨处放射性近似或高于正常骨组织，表明血运良好，植骨成活。(3)生物力学分析：通过抗扭强度等参数的分析，术后生成新骨的质量也可以得到较好的监控。(4)RT-PCR方法：有研究表明，术后3～4周开始，促进骨修复的生长因子开始从效应细胞以旁分泌等多种形式出胞表达，并持续至术后第12～14周，骨修复进入骨性连接形成期，生长因子的内源性表达出现负反馈调控，而术后第16周后，内源性骨修复相关生长因子的表达量与正常情况相比，没有显著差异。因此，本研究选择了术后第4周～12周，采用了RT-PCR的方法，对同种异体骨移植和自体骨移植后的相关生长因子的表达进行考核，通过对生成的cDNA量进行灰度分析，并与统一的内对照指标进行比较，得到各细胞因子的相对丰度，在此基础上进行统计学分析，分析骨形成相关因子的变化趋势与可能的相互作用关系。本研究主要分为三个部分：第一部分：本部分研究的目的主要是制备同种异体骨和自体骨移植的动物模型，为下一步提取骨痂总RNA奠定基础。以成年雄性新西兰大白兔为实验动物，随机分为同种异体骨移植组(30只)、自体骨移植组(30只)及取材组(10只)。然后将同种异体骨移植组和自体骨移植组，根据取材时间点(术后第4、6、8、10、12周)分别再分为5组。从取材组桡骨处制备植入物，经处理后，手术植入同种异体骨移植组桡骨处；从身体对侧桡骨处制备植入物，经处理后，手术植入另一侧肢体前臂桡骨处。术后第4、6、8、10、12周，从手术处新生成骨痂分离取材，以备RNA提取。通过对同种异体骨和自体骨移植的动物模型的制备及取材，为下一步进行RNA提取提供了实验对象。第二部分：本部分研究以移植兔桡骨为研究对象，分别于同种异体骨和自体骨植入后4、6、8、10和12周取各组节段骨痂，提取总RNA，采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测BMP-2、TGF-β和VEGF的mRNA表达。试验结果表明，通过萃取，成功获得各种因子的总RNA，经过紫外分光光度计定量，RNA产物的纯度和浓度均较高。甲醛变性电泳结果显示，各RNA条带亮度高，28S、18S、5S条带均较清晰，且28s条带的亮度与18s条带的比值均接近2倍，表明提取的总RNA基本没有降解，有较好的完整性。经过两步法扩增，BMP、VEGF、TGF-β的DNA片段大小分别为250bp、420bp和500bp，β-actin为300bp DNA片段，均与预期结果吻合。本部分研究在成功抽提总RNA的基础上，设计引物，分别扩增得到各生长因子的cDNA，与预期片段大小一致，为统计学分析提供了可靠的原始数据。第三部分：通过对上部分结果进行统计学处理和分析，利用SPSS13.0统计学软件，考核骨形成相关因子BMP-2、TGF-β和VEGF的mRNA表达与骨移植后骨形成的时间-效应关系，并比较自体骨移植与同种异体骨在三种骨形成相关因子表达上的区别。首先，本研究利用Dunnett方法，进行多重比较，分析各时间点之间的BMP-2(VEGF／TGF-β)mRNA表达量的区别，P＜0.05时判别为差异具有统计学意义。结果表明，第4、6、8、10、12周时自体移植组的BMP-2、TGF-β和VEGF的mRNA表达水平有极显著差异，F值分别为1418.186、1127.803和347.603，P值均为0.000＜0.05；第4、6、8、10、12周时异体移植组的BMP-2、TGF-β和VEGF的mRNA表达水平有极显著差异，F值分别为1429.903、1288.781和384.228，P值均为0.000＜0.05；综合进行比较，移植后第4、6、8、10、12周时BMP-2、TGF-β和VEGF的mRNA表达水平有极显著差异，F值分别为2845.873、2413.591和726.773，P值均为0.000＜0.05。在此基础上，鉴于术后第8周时自体移植组和异体移植组的BMP-2、TGF-β和VEGF的mRNA表达量平均值高于第4(61012)周时的各因子表达量平均值，提示术后第8周时，各种骨形成相关因子的表达出现所有考核时间点的最高值，有利于促进骨形成，是术后干预的最佳时机。其次，本研究采用析因分析的方法，比较自体移植组与异体移植组在术后第4、6、8、10、12周的三种骨形成相关因子的表达情况，P＜0.05时判别为差异具有统计学意义。结果表明，骨形成相关因子BMP-2、TGF-β和VEGF的mRNA表达受到组别和时间两个因素的影响，呈现出不同的时间、组别敏感性：对于VEGF，时间和组别两因素的F=2.226，P=0.079＞0.05，判别为对于VEGF的表达不存在交互效应，在此基础上，考察组别主效应的F、P值，提示自体移植组和异体移植组的VEGF表达没有显著差异，F=0.002，P=0.965＞0.05；对于BMP-2，时间和组别两因素的F=2.341，P=0.068＞0.05，判别为对于BMP-2的表达不存在交互效应，但在此基础上，考察组别主效应的F、P值，提示自体移植组和异体移植组的VEGF表达有显著差异，F=10.340，P=0.002＜0.05；对于TGF-β，时间和组别两因素存在交互效应，其F=3.035，P=0.026＜0.05，故无法单独对整个移植后时间段的组别差异的统计学意义进行判断，只能对单一时间点的组别差异进行分析，结果表明在术后第4、6、8、10、12周时，自体移植组和异体移植组的TGF-β的表达水平均无显著性差异，其F值分别为1.244、0.560、4.492、0.325和0.730，P值分别为0.291、0.471、0.060、0.581和0.413，P值均＞0.05。综合以上两个部分的研究结果，本研究的结论如下：一、同种异体骨和自体骨移植后骨组织内存在BMP2、TGF-β和VEGF的持续分泌表达，其表达趋势呈现先上升后下降的特点，且均能在术后第8周达到峰值，提示在该时间点附近进行术后干预，可能会取得良好的效果。二、比较同种异体骨和自体骨移植两个组别，多种骨形成相关因子的表达呈现出不同的时间、组别敏感性：组别及时间两个因素对于VEGF的表达不存在交互效应，F=2.226，P=0.079＞0.05，进一步地，VEGF的表达在两个组之间没有显著差异，F=0.002，P=0.965＞0.05；组别及时间两个因素对于BMP-2的表达不存在交互效应，F=2.341，P=0.068＞0.05，而BMP-2的表达在两个组之间有显著差异，F=10.340，P=0.002＜0.05；TGF-β的表达受到时间变化及组别的影响，且存在交互效应，F=3.035，P=0.026＜0.05，故不能根据组别主效应的F、P值，直接判断自体移植组与异体移植组在整个时间段的差异。