第一部分:微波消融联合骨水泥成形术治疗溶骨性骨转移瘤安全性及疗效分析提高患者的生存时间,寻求一种安全、有效的治疗方式是势在必行。热消融可以有效的缓解疼痛,甚至可以作为骨转移瘤放射治疗和吗啡治疗的替代疗法。射频消融是一种正弦电流,电流流经的区域受到离子搅动,通过离子之间的摩擦引起组织加热,从而使肿瘤细胞达到坏死。微波消融是热消融的另一种方式,其通过引起水分子的高频率振动而产热。射频加热易受组织内自由离子浓度和周围组织电导率的影响,其凝固范围的扩大主要靠传导散热。微波能量是使组织中偶极子在微波场中旋转并不断加速碰撞产生热能,在组织中有一定的穿透力,穿透范围内组织的偶极子均为发热源,受组织内自由离子浓度和周围组织电导率的影响较小,升温快、热场均匀、消融范围大、受热沉降效应影响小等,所以理论上微波消融在骨肿瘤中的凝固范围大于射频消融,并且所需消融时间短,患者耐受度强。据我们调研,国内外尚没有大规模的研究关注微波消融联合骨水泥成形术治疗溶骨性转移瘤的疗效及安全性。研究背景转移是导致恶性肿瘤患者死亡的主要原因,骨转移是继肺和肝脏之后第三常见的转移部位,大约20%肿瘤患者以骨转移为首发症状就诊。恶性肿瘤一旦扩散到骨骼发生骨转移,即为晚期无法治愈,且会带来一系列相关临床症状如难治性疼痛、骨折、运动能力下降等,严重影响了患者的生活质量。骨转移疼痛不仅发生率高,而且疼痛性质严重,剧烈疼痛的发生率为50%～90%。所以恶性肿瘤骨转移的总体治疗策略是缓解疼痛,恢复功能,提高生活质量为主要目标的姑息治疗。近年来的综合治疗方式,如抗肿瘤化疗、止痛、双磷酸盐、外科手术及放疗等的综合利用,已经在缓解患者疼痛,恢复功能,提高生活质量及延长患者生存等方面作出了贡献。如放疗(外照射),是治疗骨转移局部疼痛的标准治疗方式,疼痛缓解率可达40～80%,数据显示放疗1月内超过40%的患者疼痛程度减轻一半,约30%患者疼痛完全缓解,但是57%的患者在放疗后4月内出现疼痛反复。对于椎体转移瘤而言,放疗对维持椎体的稳定性效果差。外科手术可以解决脊柱不稳定的问题,可以选择性用于病理性骨折或脊髓压迫的患者,也用于预防治疗某些病理性骨折危险的骨转移病人。但手术创伤大、愈合时间长,并发症发生率可达24%,仅适用于部分一般状况良好,可耐受麻醉及手术的患者。双膦酸盐治疗是肿瘤骨转移的基础用药,可以减缓和延迟骨相关事件的发生。缺陷是长期使用需要补充钙及维生素D,且有下颌骨坏死和肾功能损害的风险,并且双膦酸盐治疗不能取代现有的止痛治疗、放射治疗和其他治疗手段。微创技术的发展为骨转移瘤的治疗提供了多种治疗手段。经皮椎体/骨水泥成形术是在X线或CT引导下将骨水泥注入到病变骨骼。骨水泥在注入骨骼后大约8～10分钟后硬化,在此过程中同时放热,达到止痛、稳定椎体的作用。然而经皮椎体/骨水泥成形术对于恶性肿瘤骨转移的治疗存在一定局限性。骨转移瘤瘤体内压力高,需要高压注入骨水泥,这样不仅容易导致水泥渗漏,还有可能促进肿瘤细胞的血行转移,增加了癌细胞扩散的可能。所以为更好缓解骨转移瘤患者的疼痛,改善患者生活质量,研究目的本研究对27例溶骨性骨转移瘤患者进行了 CT引导下微波消融联合骨水泥成形治疗,观察疼痛缓解、体力状况改善、并发症情况;对椎体转移瘤患者还进行脊柱功能状态、生活质量及脊柱损伤神经功能评分;采用欧洲五维度健康指数量表(EuroQol five Dimensions questionnaire,EQ-5D)指数(采用日本时间权衡法Time Trade-off,TTO获得EQ-5D指数得分)和欧洲癌症研究与治疗组织的生活质量骨转移量表(Europe Organization for Research and Treatment of Cancer Quality of Life Questionnaire-Bone Metastases 22,EORTC QLQ-BM22,简称QLQ-BM22)综合评价患者的生活质量;采用EQ-5D指数和QLQ-BM22评分分别计算出质量调整寿命年(Quality-adjusted life years QALYs)进行生存分析,以探讨微波消融联合骨水泥治疗溶骨性骨转移瘤的安全性及疗效。研究方法收集自2019年1月至2020年8月在山东大学附属济南市中心医院肿瘤科接受微波消融联合骨水泥成形术治疗的27例溶骨性骨转移瘤患者的临床资料。所有入组患者均有有明确的肿瘤病史,病理学诊断,合并疼痛症状;CT或MR显示溶骨性骨转移瘤并且骨转移瘤影像学定位与压痛、叩击痛等疼痛部位一致;其他远处转移如肝、肺转移灶病情稳定,临床无阳性症状;肝肾功能、凝血指标均无穿刺禁忌。微波消融联合骨水泥成形术操作全程在CT引导下进行,治疗前充分告知患者及家属消融联合骨水泥成形治疗的目的、预期疗效、主要风险、可能并发症及相应的应对措施、替代疗法、术前及术后注意事项等,取得患者及家属同意后,签署知情同意书。术前4小时禁饮食、饮水。麻醉采用局部麻醉加止痛方式,严格执行无菌操作技术规范。微波消融功率30～50W,消融时间1.5～15min。消融过程中根据CT结果调整消融针的位置、角度及深度,目的是消融区域覆盖肿块;同时观察患者生命体征、疼痛等情况,根据术中患者耐受程度随时调整消融功率及时间。消融结束,拔出消融针,调制骨水泥,待水泥处于拉丝期时将骨水泥缓慢低压灌注入骨转移瘤消融后部位,骨水泥的用量1.5～9ml。术后即刻CT扫描,观察治疗后骨水泥的位置,评估术中并发症。采用疼痛数字评分(Numerical Rating Scale,NRS)比较患者术前、术后1天、3天、1周、1月、3月、6月疼痛分值变化;采用卡氏体力状况评分(Karnofsky’s Performance Status,KPS)量表、QLQ-BM22 量表、TTO评分、腰痛 Oswestry 功能指数(Oswestry Disability Index,ODI)评分和美国脊髓损伤协会神经学检查(American Spinal Injury Association,ASIA)评分比较患者术前、术后1周、1月、3月、6月各分值的变化。观察是否出现术后并发症。采用EQ-5D指数(即TTO数值)和QLQ-BM22评分作为生存质量得分,乘以各自维持的时间跨度得到QALYs,用以生存分析。研究结果1、截至末次随访,随访时间1～20月,27例溶骨性骨转移瘤患者均按规范性操作,结合患者骨转移瘤的数量及症状决定患者的术部位,其中10例患者同时行2处转移瘤的治疗,17例患者行1处转移瘤的治疗,共计37个手术部位。技术成功率100%。2、27例患者中男19例,女8例;年龄37～80岁,年龄均值65.7±11岁;原发病最多的是肺癌,病理类型最多的是腺癌;肿瘤直径大小(cm)与消融功率及骨水泥用量相关,与消融时间不相关;转移瘤体积(cm3)与消融功率、时间及骨水泥用量均相关;术前疼痛持续时间与消融时间及骨水泥用量的关系,与消融功率无关。3、并发症:所有患者随访时至少1次行强化CT检查,均未见治疗后局部肿瘤复发。无感染发热、再骨折、肺栓塞及截瘫并发症;无围手术期死亡事件及消融后综合征发生。4例发生周围组织渗漏、2例渗入转移瘤周围血管、1例渗入椎管,并发症发生率为18.9%,均为轻微并发症,无主要并发症发生。4、疼痛情况:术前NRS评分3～9分,中位评分为6.52,术后1天NRS中位评分为3.44,NRS中位评分持续下降,术后6月为1.92,P<0.0001,差异有统计学意义。NRS性别、年龄、骨转移瘤的数量、转移瘤的最大直径、转移瘤的体积及术前疼痛持续时间对疼痛均无显著影响(P>0.05)。5、生活质量:KPS中位评分由术前的61.11,术后1周63.70,术后1月64.61,术后3月54.2,再到术后6月的46.67,P>0.05,统计学没有意义。EQ-5D的评估是采用TTO积分换算得出。TTO中位评分术前0.41,术后1周0.58,术后1月0.55,术后3月0.52,术后6月0.45,总体有好转趋势,首先改善的是疼痛不适及焦虑抑郁两项,其次是行动能力,最后是自我照顾能力和日常活动能力,但P>0.05,没有统计学意义。QLQ-BM22中位评分术前的51.81,术后1周40.8,术后1月41.80,术后3月38.29,术后6月38.00,P=0.0013,差异有统计学意义。性别、年龄、骨转移瘤的数量、转移瘤的最大直径、转移瘤的体积及术前疼痛持续时间等与QLQ-BM22不相关(P>0.05)。27例微波消融联合骨水泥治疗的患者中共20例脊柱转移患者,其中有17例胸腰椎转移。对17例胸腰椎转移患者进行ODI评分;对20例脊柱转移患者进行ASIA评分。ODI中位评分术前60.40%,术后1周47.00%,术后1月48.18%,术后3月37.78%,术后6月39.16%,由重度功能障碍,变为中度功能障碍,P>0.05,没有统计学意义。除死亡患者外,余患者ASIA评分在术前、术后1周、术后1月、术后3月及术后6月均无变化。6、生存分析:随访时间为1～20月,7例患者6月内死亡,死于原发疾病进展,2例死于严重肺部感染,1例死于感染性休克。死亡患者存活时间为0.25～9月,中位生存时间为:3.14 ± 3.24月。采用EQ-5D指数和QLQ-BM22评分分别作为生存质量得分。采用EQ-5D指数(即TTO数值)作为生存质量得分时,中位QALYs分值术前0.039,术后1月0.488,术后3月0.0902,术后6月0.142,P<0.0001,差异有统计学意义;采用QLQ-BM22评分作为生存质量得分时,中位QALYs分值术前0.061,术后1月0.032,术后3月0.0653,术后6月0.108,P=0.0002,差异有统计学意义。研究结论1、CT引导下行微波消融联合骨水泥成形治疗溶骨性骨转移瘤,技术成功率高,手术可操作性强。2、骨转移瘤的最大直径、体积及术前疼痛持续时间是微波消融的功率及时间的影响因素,也是骨水泥用量的影响因素。3、微波消融联合骨水泥成形治疗溶骨性骨转移瘤并发症少,安全可靠。4、微波消融联合骨水泥成形可以快速、有效、持久缓解溶骨性骨转移瘤患者的疼痛,提高患者的生活质量,延长患者高质量的生存时间。5、微波消融联合骨水泥成形治疗骨转移瘤,两个治疗方式联合可以相互补充单个治疗方式的缺陷。微波消融术可以减少骨水泥治疗的渗漏并发症,减少骨水泥所致转移瘤细胞沿引流静脉扩散的风险;骨水泥成形术可以减少消融后综合征的发生率。第二部分:生物信息学方法分析不完全射频消融导致结肠癌细胞相关休眠基因的激活研究背景休眠作为一种自然界生物对适应环境的生存策略,普遍存在于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物中。肿瘤为满足自身需求,适应不同的微环境也会存在休眠状态。肿瘤休眠可发生在肿瘤发生发展的各个阶段,如①远处转移:肿瘤细胞从原发部位到转移部位,大都经历了一段时间的休眠;②术后复发或转移前潜伏期:20%-45%乳腺癌、前列腺癌患者术后数年或数十年再复发;③治疗后无症状带瘤生存患者的无疾病进展期等。肿瘤休眠的特点是癌细胞进入生长停滞状态,细胞周期停滞在G0/G1期,低表达Ki-67和增殖细胞核抗原(PCNA),新陈代谢低,具有活跃的耐药机制等。肿瘤休眠可分为肿瘤块休眠和肿瘤细胞休眠或细胞休眠。肿瘤休眠细胞相对于亲代细胞有不同的表达谱。肿瘤休眠时AKT被抑制,可以激活阻止细胞周期的周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21和p27,从而抑制细胞生长。EGFR突变的非小细胞肺癌在TKI治疗后,可以诱导肺癌细胞休眠,并且这些休眠的细胞具有耐药性。缺氧也可以诱导休眠。所以,肿瘤休眠可能是肿瘤进化过程中的一种自然状态。休眠的肿瘤细胞可以发展出非特异性的抵抗细胞死亡机制,如下调JAK/STAT通路,上调GAS6、BMP4/7及TGF β2的表达等。休眠肿瘤细胞的存在可能是患者预后差的原因之一。所以,对肿瘤休眠的深入研究,可以了解疾病未来进展信息;可以作为药物治疗后肿瘤细胞逃避凋亡并存活的机制。肿瘤热消融是指利用热产生的生物学效应直接导致靶肿瘤发生凝固性坏死的原位灭活技术。目前临床常用的热消融主要是射频消融(RFA)及微波消融(MWA)。热消融不仅可以减轻肿瘤负荷、缓解肿瘤引起的症状及提高患者生存质量,而且与其他抗肿瘤药物联合使用可以提高局部控制率、延长患者生存。尽管热消融在肿瘤治疗中有许多优点,但是在某些患者中的治疗效果仍具挑战性。包括实现大于3cm肿瘤的完全消融;热消融可能与更高的肿瘤复发率有关,部分原因是难以实现大于5mm的消融周缘等。研究发现不全射频消融(iRFA)可以促进肿瘤生长。可能的促癌机制有:①iRFA后的正常肝组织可以增加促癌因子IL-6,HGF,c-Met及VEGF等的生成,从而发挥促肿瘤生长的作用;②体外实验发现,大鼠乳腺癌细胞、人乳腺癌、结肠癌等细胞受中度高温后,IL-6、TNFα、STAT3和HGF等因子表达升高,细胞增殖加快,以此推测热消融过程中,遇到中等温度的消融周边区域肿瘤细胞可能是被诱导激活;③iRFA促进间质中VEGF的升高,导致微血管生成;还可以通过活化VEGF上游驱动因子,如IL-6、HGF和c-Met,间接导致以VEGF驱动的微血管生长增殖。④iRFA诱导的自噬有促癌作用。总之多项研究表明iRFA可以促进残余肿瘤细胞的生长,那么iRFA是否可以导致肿瘤休眠细胞的激活,目前尚无报道。研究目的本研究从GEO上下载GSE138224数据集进行分析,识别差异基因,将差异基因表达数据进行功能分析、功能聚类,以探讨不全射频消融对结肠癌基因表达水平的影响及高表达基因的功能分析,有利于明确热消融后肿瘤复发的原因、丰富肿瘤耐药机制、寻找新的抗肿瘤治疗靶点。研究方法1、本研究从GEO上下载GSE138224数据集,利用NetwrokAnalyst网站,通过EdgeR方式,设为logFC(fold change)>l,adj.P<0.05为有统计学意义的数据,得出差异表达基因(DEGs)。2、将DEGs进行KEGG分析和GO分析,P<0.05有统计学意义。3、利用STRINNG数据库分析差异基因蛋白互作网络(PPI)及确定核心基因。置信度分值设为900以上为有统计学意义,关键PPI网络选择标准为节点>3,贡献度≥10。研究结果1、将6个样本中的高通量数据进行标准化后,得到16161个基因,从其中得到656个DEGs,其中637个下调基因,19个上调基因。热消融的目的是将肿瘤细胞杀灭,引起肿瘤细胞的凝固性坏死,所以大部分基因的表达下调为治疗后正常现象,相反出现了上调基因,说明可能存在复发因素,因此研究iRFA后上调基因的表达更具有临床意义。2、从上调基因的KEGG分析可以看出差异基因参与的信号通路有toll-样受体信号通路、TNF信号通路和自然杀伤细胞介导的细胞毒性等;上调基因GO分析结果中G0:BP聚集在免疫效应过程,JAK-STAT通路级联反应、STAT蛋白酪氨酸磷酸化过程,STAT蛋白酪氨酸磷酸化的调控等方面;值得注意的是Cc15基因参与调控JAK-STAT信号通路;上调的差异基因GO:MF分析基因主要富集在酶激活物活化、趋化因子活化及激酶激活物活性等。DEGs中的上调基因在GO:CC分析时没有取得有统计意义的结果。3、得出3个关键PPI网络,休眠相关基因Bmp4和Ccl5作为核心基因分别位于关键PPI网络中;且Bmp4是下调基因,Cc15是上调基因。研究结论1、与未经处理的结肠癌细胞相比,iRFA后肿瘤细胞存在高表达基因,这些高表达基因可能是iRFA术后肿瘤复发的原因。2、iRFA处理后的结肠癌细胞高表达肿瘤休眠相关基因Cc15及低表达休眠抑制基因BMP4。3、iRFA处理后的结肠癌细胞高表达肿瘤休眠相关相关JAK/STAT信号通路。4、iRFA处理后的结肠癌细胞高表达Cc15可能通过JAK/STAT信号通路激活休眠肿瘤细胞。