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研究目的: Pantoea vagans,肠杆菌科泛菌属革兰染色阴性菌株,存在于各种各样的自然环境中,被认为是植物内生菌,很少有报道引起人类感染性疾病.我们从临床患病新生女婴的标本中分离得到一株对若干药物表现出抗性的 Pantoea vagans PV989菌株,为了进一步研究细菌耐药性和致病性的分子机制,我们对其进行临床常用药物的敏感性分析和全基因组测序,对其携带的三个大质粒进行比较基因组学分析.分析质粒编码的耐药性、致病性相关基因的起源、遗传变异规律及进化,探讨质粒编码基因与可移动DNA元件的关系,为进一步研究Pantoea vagans PV989菌株的耐药性、致病性机制打下良好的基础,为临床治疗提供帮助. 研究方法: (1)临床患儿标本中分离纯化菌株PV989,全自动微生物鉴定仪进行初步鉴定. (2)碱裂解法提取菌株PV989全基因组,送公司进行全基因组测序,对获得的reads序列进行拼接和校正,获得完整的全基因组序列,对全基因组序列进行开放阅读框预测(ORFs),并对其进行注释. (3)选择各类抗生素,以美国临床实验室标准化协会(CLSI)颁布的最新版指南文件中的最低抑菌浓度(MIC)值作为参照,琼脂平板稀释法测定最低抑菌浓度,检测菌株对抗生素的抗性. (4)利用在线工具RNAmmer预测16S rRNA,选择管家基因gyrB、rpoB、atpD和infB进行多位点序列分析(MLSA),判断菌株PV989所属种属. (5)利用Mauve等工具,大质粒pPV989-508与NCBI核酸数据库中相似的质粒进行序列同线性比较,大质粒序列ORFs进行同源性比对,探究其携带的基因可能使菌株具备的功能. (6)利用Blast等工具,对中质粒pPV989-167上毒力相关基因(亚铁离子转运系统、Ⅰ型分泌系统和Ⅰ型菌毛系统)和耐药结节细胞分化超家族相关基因(耐药外排泵系统)进行基因组学比较,进行可视化作图. (7)利用CGview等可视化工具制作小质粒pPV989-94物理图谱并进行基因组学比较,粗略确定基本结构,检索有着相似骨架结构的质粒,比较分析可移动DNA 元件,并对可移动元件携带的基因进行单核苷酸多态性分析,收集相似序列建立系统发育树. 研究结果: (1)菌株PV989由1个染色体和3个质粒组成,全基因组大小约4.61M,染色体大小为3.88M,三个质粒大小分别为508kb、167kb和94kb. (2)肠杆菌科对照菌株大肠埃希菌ATCC25922 MIC值除万古霉素抗生素外均在控.菌株PV989对氨基糖苷类抗生素、大环内酯类抗生素、四环素类抗生素、β内酰胺酶类抗生素、磺胺类抗生素均敏感,对氟喹诺酮类抗生素加替沙星敏感却对左氧氟沙星耐药. (3)16S rRNA和管家基因gyrB、rpoB、atpD和infB同源性比对显示与泛菌属Pantoea vagans特征性株菌C9-1最相似. (4)大质粒pPV989-508与泛菌属Pantoea vagansC9-1的质粒pPag3、成团泛菌菌株FDAARGOS质粒unnamed2、成团泛菌菌株C410P2质粒unnamed1最为相似,并且和前两者有较好的同线性,与后者相比有部分重排和倒置.大质粒pPV989-508上有着和菌株C9-1质粒pPag3高度相似的硫胺素合成基因、去铁胺可扩散性铁载体合成基因和麦芽糖代谢相关基因. (5)中质粒pPV989-167与菌株C9-1质粒pPag1共有147个ORFs,分别占两者总ORFs的96.71%和95.45%,蔗糖代谢相关基因和亚铁离子转运系统基因相似度值均大于98.5%.Ⅰ型分泌系统、Ⅰ型菌毛系统以及外排泵系统与其他菌株上相应片段相似,三个系统所在片段各有差异. (6)小质粒pPV989-94的结构分析结果显示,该质粒可分为4个区域,进一步分析发现pPV989-94与水果树上的解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)质粒LA637P2和pEA68最相似.小质粒存在可变区域R4,由噬菌体整合酶和噬菌体整合酶家族的位点特异性重组酶介导水平转移,携带有与糖代谢(gloA、gpmA、eno、ppaC、mae1、HET-E-1)、抗性(crcB、uspA)和DNA修复(ung)有关的9个基因. 研究结论: (1)临床来源菌株PV989属于泛菌属Pantoea vagans菌种,菌株全基因组大小与NCBI数据库已拼接完成的菌株Pantoea vagans典型菌株C9-1大小相近. (2)菌株PV989对大多数临床常用药物敏感,仅对左氧氟沙星耐药. (3)大质粒pPV989-508使得菌株PV989具有合成硫胺素、去铁胺可扩散性铁载体、麦芽糖代谢的能力,菌株PV989功能与Pantoea vagans菌株C9-1有异同. (4)中质粒pPV989-167编码的Ⅰ型分泌系统、Ⅰ型菌毛系统和耐药外排泵与泛菌属和欧文氏菌属质粒相应基因同源,但所在片段结构各有不同,并且中质粒具有编码蔗糖代谢和亚铁离子转运等功能的基因. (5)小质粒pPV989-94和解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)质粒LA637P2和pEA68享有共同的骨架序列,有着共同的祖先基因.可移动DNA元件能进行水平传播,所携带的基因 gloA 和 crcB 经历了净化选择,系统发育树表明 uspA和ung与阪崎肠杆菌对应基因最为接近.