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根是使植物固着于土壤里的关键器官,植物借助根从土壤里吸收生命活动所必需的水分及营养物质。侧根是根系结构的重要组成部分,是从已发育完全的根组织中分化形成的根,往往循环不断的产生,最终发育成交织繁杂的根系网络,对植物适应环境和再生起着重要作用。植物的生长发育需要多层次因素的共同调节,包括内源的激素、环境因素以及转录后水平的小RNA(miRNA)等。微小RNA(miRNA)是一类长约21个核苷酸(nt)的小型非编码调控RNA,通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA,并根据互补程度的不同,指导沉默复合体降解靶mRNA,或者阻遏靶mRNA的翻译。miRNA广泛分布于植物的基因组中,参与植物多种器官的形态建成和生长发育过程。miR319是最早被鉴定的一种miRNA,参与叶片形态建成、花器官发育、芽顶端分生组织的分化及逆境胁迫等多过程的调控,然而miR319在根发育过程中的作用目前仍是未知的。杨树是世界范围内广泛分布的重要树种,具有生长快,实用性强的特点,在木材生产、城市绿化和生态维持中发挥着不可替代的作用。研究杨树根系发育过程可为筛选和培育具有环境适应性和更具产业价值的优良树种提供理论基础,具有重要的意义。本研究以毛白杨为研究材料,探索miR319a在杨树根发育中的作用及分子机制。具体研究结果如下:1.miR319a调控毛白杨侧根的形成本研究通过遗传转化将miR319a自身启动子驱动GUS蛋白基因在毛白杨体内表达,进行GUS染色分析发现miR319a在毛白杨根、茎、叶中均有表达。对根系进行进一步的观察表明,miR319a在不定根和侧根中均有表达。通过遗传转化获得miR319a超表达及抑制表达的转基因株系,在水培的条件下观察根系的发育情况。结果表明,miR319a超表达导致侧根的数量和密度均受到明显抑制,而抑制miR319a表达则导致相反的表型,说明miR319a负调控侧根的发育。2.TCP19正调控侧根的形成miR319a靶向调控6个毛白杨TCP转录因子,分别为TCP4、TCP9、TCP19、TCP20、TCP24和TCP34。这6个TCP基因在miR319a超表达及抑制表达的株系中均受到不同程度的靶向调控,其中以TCP19受到miR319a的表达调控最为显著。通过在侧根发育的不同时段(0、1、3、5、7、9天)检测基因的表达量,发现TCP基因表达水平随着发育阶段的不同而变化,其中以第5天的表达水平为最高,说明TCP基因的表达水平与侧根发育相关。在野生型的根中,TCP19表达水平最高,因而被挑选进行后续研究。将TCP19与酵母表达载体pGBKT7融合,转入酵母细胞中发现TCP19具有转录抑制活性。组织表达普分析显示,TCP19在杨树根及叶片中具有相对较高的表达水平,在茎中表达水平较低。进一步构建TCP19的超表达载体,遗传转化获得TCP19基因超表达植株,观察表型发现,与野生型相比,超表达株系的侧根密度和数量均显著增加,说明TCP19可正调控毛白杨侧根的形成。3.TCP19转录激活活性分析及组织表达情况分析将TCP19与酵母表达载体pGBKT7融合,转入酵母细胞中,通过显色反应观察转录激活活性,结果显示TCP19具有转录抑制活性。组织表达谱定量检测分析,发现TCP19在根部与叶片中具有相对较高的表达水平,在茎中表达较低。4.生长素信号参与miR319a对根系的调控过程将生长素响应基因DR5的启动子与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合,二次转化于miR319a超表达及抑制表达的转基因株系中表达,通过观察根系发育过程中的荧光信号,发现生长素信号强度受到miR319a表达的影响。同时,外源的NAA及NPA处理能够在一定程度上恢复miR319a表达对根系发育的影响,说明miR319a对根部发育的调控与生长素信号直接相关,且生长素信号极有可能在其中发挥关键作用。5.生长素相关基因受到miR319a表达影响对miR319a转基因株系中生长素合成、转运和响应的相关基因表达水平进行分析,发现生长素转运基因PIN5b、IAA3.1、IAA3.2受到miR319a表达的显著调控。进一步分析启动子元件,发现生长素响应基因IAA3.1和IAA3.2基因启动子序列中分别包含一个和两个II类TCPs的结合位点。6.IAA3.2负调控侧根的形成已有研究表明,IAA3.2基因负调控侧根形成。构建IAA3.2超表达的pCXSN表达载体,遗传转化获得转基因株系,发现IAA3.2过量表达导致侧根的数量和密度明显下降,说明IAA3.2负调控侧根形成。上述结果暗示,miR319a的靶标基因TCP19可能通过调控IAA3基因的表达影响根系发育。7.miR319a靶标基因TCP19可直接结合IAA3.2启动子调控其表达为验证上述假设,利用Effector-Reporter及CHIP-qPCR实验,证明TCP19可结合在IAA3.2的启动子上,对IAA3.2的表达产生抑制作用。综上所述,miR319a靶向调控TCP19基因表达水平,后者可结合到IAA3.2的启动子上,下调其表达,进而抑制侧根的形成。本研究揭示了miR319a/TCP19模块通过影响生长素信号实现对侧根发育的调控机制,为毛白杨根系发育机制解析提供了新的证据。