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受精是哺乳动物有性生殖的基本过程,精卵融合是受精过程的关键步骤,它是由多个分子共同参与并协助完成的过程。研究发现,哺乳动物的精卵融合除了必需有精子的IZUMO1与卵子的JUNO相互作用外,还需要PDIA3、CRISP2、SPACA3以及SPACA1等多种其他精子或卵子上的蛋白相互作用。本研究用酵母双杂交和免疫共沉淀技术在分子水平上鉴定了大鼠SPACA1与SPACA3之间的相互作用。并利用间接免疫荧光技术对SPACA1与SPACA3、PDIA3与SPACA3、PDIA3与CRISP2在大鼠和绵羊精子上进行共定位。为全面理解精卵融合的分子机制提供了新的资料。首先,我们克隆了大鼠spaca1和spaca3的cDNA及绵羊pdia3、crisp2和spaca3的cDNA,构建pGBK-spaca1与pGAD-spaca3酵母表达载体和pCMV-C-HA-spaca1与pCMV-C-Flag-spaca3真核表达载体,分别用酵母双杂交和免疫共沉淀的实验方法鉴定发现SPACA1与SPACA3之间存在相互作用。鉴定蛋白的细胞和亚细胞定位需要抗体。为了制备大鼠SPACA1和SPACA3以及绵羊PDIA3、CRISP2和SPACA3的抗体,我们构建了大鼠pET-28a-spaca1、pET-28a-spaca3、绵羊pGEX-pdia3、pGEX-crisp2和pGEX-spaca3原核表达载体,分别转入E.coli BL21（DE3）细胞中诱导表达,得到了SPACA1-HIS、SPACA3-HIS、PDIA3-GST、CRISP2-GST和SPACA3-GST重组融合蛋白。用SPACA3-HIS、PDIA3-GST免疫家兔、SPACA1-HIS、CRISP2-GST、SPACA3-GST免疫小鼠,得到了兔抗大鼠SPACA3、兔抗绵羊PDIA3血清和小鼠抗大鼠SPACA1、小鼠抗绵羊CRISP2、小鼠抗绵羊SPACA3腹水多克隆抗体。然后,以自制兔抗大鼠SPACA3血清和小鼠抗大鼠SPACA1腹水多克隆抗体为一抗,鉴定了SPACA1和SPACA3在大鼠睾丸组织和精子上的定位。结果显示:SPACA1存在于精子细胞和睾丸曲细精管中成熟精子上,在支持细胞和间质细胞中均不表达;SPACA3表达于大鼠睾丸组织的间质细胞、精原细胞和精母细胞中,主要存在于成熟精子中。精子发生顶体反应后,SPACA1与SPACA3能共定位于精子头部赤道段。以自制兔抗绵羊PDIA3血清、小鼠抗绵羊CRISP2和小鼠抗绵羊SPACA3腹水多克隆抗体为一抗,鉴定了PDIA3、CRISP2以及SPACA3在绵羊精子上的共定位。结果显示:Ca2+诱导的精子顶体反应发生后,SPACA3与PDIA3共定位于精子头部的赤道段,而PDIA3与CRISP2不存在共定位。论文结果说明,精子溶酶体相关蛋白SPACA3与SPACA1和PDIA3在精子顶体反应后发生相互作用,共同参与精子与卵子结合或融合过程,而CRISP2与PDIA3可能独立参与精卵结合或融合过程,二者的相互作用不发生在精子上,可能发生在细胞生物学的其他过程中。