脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，约占颅内原发肿瘤的45～55%。尽管目前包括影响学、手术、放射治疗和化学治疗等综合诊疗水平不断提高，但脑胶质瘤患者的预后并未得到显著改善，GBM患者的平均生存时间不到1年。胶质瘤的病理级别、手术切除程度和对放化疗敏感程度是影响脑胶质瘤患者预后的主要因素，但临床上常可见同一病理级别、同样手术全切除并行相同放化疗方案的患者出现截然不同的预后，有的短期内复发，有的可获得长期生存。这种生存时间的差异很有可能与个体对放化疗敏感程度不同密切相关。胶质瘤化疗敏感相关的分子病理机制极为复杂，涉及多个基因、多个因素共同参与，并通过多个分子事件、多种途径共同完成。因此有必要深入探讨胶质瘤化疗敏感性分子调控机制，为提高胶质瘤患者化疗疗效提供新的研究思路和理论依据。STMN1(Stathmin1)由Sobel A等在1983年首先报道，是近年研究较多的一种微管解聚磷蛋白，通过磷酸化水平的自身调节影响微管动力系统平衡，参与许多信号通路的调控。STMN1在许多肿瘤组织中表达上调，因此又被称为oncoprotein18(OP18)。在正常细胞中，STMN1主要参与细胞周期、凋亡和细胞运动的调控，而在一些恶性肿瘤中，STMN1高表达与肿瘤的恶性程度、侵袭和远处转移有关，并与肿瘤患者对一些化疗药物的反应和不良预后相关。课题组前期通过基因芯片技术结合生物信息学分析发现STMN1为胶质瘤化疗敏感相关基因之一，不但与胶质瘤本身的生物特性如增殖、凋亡、侵袭、细胞周期等改变有关，体外敲减后还可明显改变胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性，但其机理尚不清楚。本研究拟通过体外在四个GBM细胞株中筛选STMN1表达差异，构建STMN1慢病毒干扰及过表达载体并转染GBM细胞株，建立STMN1表达水平不同的胶质瘤细胞株，测定其对TMZ的敏感性。进一步在STMN1敲除的胶质瘤细胞株中观察自噬和凋亡水平，最后通过抑制自噬和凋亡后检测其对TMZ敏感性的改变，从而研究自噬和凋亡在STMN1调控胶质瘤化疗敏感性中的作用。实验分为三部分：第一部分，STMN1与胶质瘤细胞对TMZ化疗敏感性的关系；第二部分，研究凋亡在STMN1调控胶质瘤细胞对TMZ敏感性中的作用；第三部分，探讨自噬在STMN1调控胶质瘤细胞对TMZ敏感性中的作用。第一部分STMN1与胶质瘤细胞对TMZ化疗敏感性的关系目的：研究STMN1与胶质瘤化疗敏感性之间的关系，验证STMN1敲除及过表达后GBMs细胞株对TMZ化疗敏感性变化。方法：分别应用Real-time PCR（实时荧光定量PCR）和Western-blot方法检测四个GBM细胞株的STMN1mRNA和蛋白表达水平，并应用CCK-8法测定此四株细胞株经TMZ处理后的细胞活力变化。构建STMN1干扰和过表达载体并转染GBM细胞株，采用Real-time PCR和Western-blot鉴定转染效率，并用CCK-8法测定其对TMZ敏感性。结果：STMN1mRNA表达水平依次为U251-MG>A172>U87-MG>T98G，但两两之间均未达到统计学显著性差异（P>0.05）。STMN1蛋白表达水平与STMN1mRNA表达水平趋势一致，T98表达量最低，与A172组存在统计学显著差异（P<0.05），与U251组存在极显著统计学差异（P>0.01）；U251与A172组间未存在统计学差异；A172与U87组间存在显著差异（P<0.05）。U251、A172、U87和T98经TMZ处理后细胞活力依次降低，但两两之间未达到统计学差异（P>0.05）。U251和T98干扰STMN1组的干扰效率均约为60%，两株细胞的过表达组的STMN1表达量均约为空白对照组的2倍。U251+STMN1干扰+TMZ组在TMZ处理72h后极显著低于U251组（P<0.01）。T98+过表达+TMZ组随着培养时间的增加，细胞活力呈下降趋势，无统计学意义（P>0.05）。结论：STMN1表达水平与其对TMZ的敏感性呈负相关，STMN1敲除后U251对TMZ的敏感性增加，STMN1过表达后T98对TMZ的敏感性变化不显著。第二部分凋亡在STMN1调控胶质瘤细胞对TMZ敏感性中的作用目的：研究STMN1靶向敲除后U251对TMZ化疗敏感性增加与凋亡的关系。方法：选择STMN1干扰的U251细胞株，利用流式细胞仪检测其经TMZ和顺铂（Cisplatin）作用后的凋亡率；用Z-VAD(OMe)-FMK抑制凋亡，CCK8法测定其对TMZ的敏感性。结果: U251+干扰+TMZ组较U251+干扰细胞凋亡率显著增加，达到统计学差异（P<0.05），但U251+干扰+TMZ组的凋亡率低于U251+干扰+Cisplatin组，达到统计学极显著差异（P<0.01）。（Z-VAD(OMe)-FMK+TMZ）组的OD值，即细胞活力显著低于相应对照组（P<0.05）。U251（RNAi-STMN1）+（Z-VAD(OMe)-FMK+TMZ）组的OD值显著高于U251（RNAi-STMN1）+TMZ组（P<0.05）。U251（RNAi-STMN1）+TMZ较U251（RNAi-STMN1）组活力极显著降低（P<0.01）。结论：TMZ可诱导GBM细胞发生凋亡，但凋亡率显著低于顺铂。凋亡抑制后U251(RNAi-STMN1)对TMZ的敏感性降低，说明STMN1RNAi干扰后U251对TMZ的敏感性增加可能与凋亡有关，至少凋亡参与了这一过程。第三部分自噬在STMN1调控胶质瘤细胞对TMZ敏感性中的作用目的：研究STMN1靶向敲除后U251对TMZ化疗敏感性增加与自噬的关系方法：采用透射电镜观察U251（Si-STMN1）经TMZ诱导后自噬超微结构-自噬溶酶体的变化。采用Western-blot方法检测U251和A172经TMZ诱导后自噬相关基因/蛋白LC3，Beclin1和ATG5表达水平。用GFP-LC3B示踪法在激光共聚焦显微镜下观察U251（Si-STMN1）经TMZ诱导后自噬水平，以及自噬抑制后荧光变化，同时采用Real-time PCR和Western-blot方法定量检测自噬相关基因和蛋白表达水平。分别用3-MA和bafilomycin A1早期和晚期抑制自噬，用CCK8法测定U251（Si-STMN1）对TMZ的敏感性。结果：U251经TMZ诱导后细胞质中有自噬泡出现， U251(Si-STMN1)经TMZ诱导后，细胞器出现破坏较前两组严重一些，细胞质中的自噬泡慢慢增多。在两株GBMs细胞株中，就LC3，Beclin1和ATG5基因mRNA和蛋白表达量而言，U251经TMZ诱导后显著增加（P<0.05），U251(Si-STMN1)经TMZ诱导后极显著增加（P<0.01）（除STMN1干扰后的A172中ATG5和LC3蛋白为显著增加外）。U251+SiRNA+TMZ+3-MA/Baf与U251+SiRNA+TMZ组相比自噬泡数量减少达到统计学显著差异（P＜0.05）。自噬早期或晚期抑制后，TMZ诱导的自噬仍增强，自噬相关基因/蛋白(LC3、Beclin1和ATG5)表达量明显升高。自噬早晚期同时抑制后，U251+干扰+TMZ+3-MA+Baf组与单纯U251+干扰+TMZ处理组相比细胞活力降低达到统计学显著差异（P<0.05）；而单独的早期或晚期抑制后，U251+干扰+TMZ+3-MA/Baf组与单纯U251+干扰+TMZ处理组相比细胞活力增加未达到统计学显著差异（P>0.05），但早期抑制较晚期抑制细胞活力高。结论：TMZ可诱导U251及U251(Si-STMN1)发生自噬，自噬相关基因/蛋白明显增加；自噬早晚期同时抑制后，U251(Si-STMN1)对TMZ的敏感性增加，说明自噬对胶质瘤细胞起保护作用，降低TMZ毒性。