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目的:
利用超速离心机,根据密度梯度离心法分离纯化DNA Origami/DNATetrahedron,期望通过该方法能够将DNA Origami/DNA Tetrahedron中的单体和聚体很好分开。
基于氧化石墨烯(GO)和奥曲肽(Octreotide)构建的纳米生物传感平台,进行简单、快速、灵敏的检测奥曲肽抗体和大鼠胰腺外分泌细胞,从而用于神经内分泌肿瘤的早期检测与诊断。
方法:
1.DNA Origami的分离纯化:以甘油为密度梯度介质,根据密度梯度离心法中的速率区带离心法分离纯化,离心完毕,人工取样分装收集离心管中所得到的离心液,然后用0.7%的琼脂糖凝胶电泳表征验证离心分离的效果。
2.DNA Tetrahedron的分离纯化:分别以甘油和蔗糖为密度梯度介质,根据密度梯度离心法之速率区带分离纯化DNA Tetrahedron,离心完毕,人工取样分装收集离心管中的所有离心样品,然后用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳表征验证离心分离的效果。
3.基于氧化石墨烯(GO)和奥曲肽(Octreotide)构建的纳米传感平台快速、灵敏地检测奥曲肽抗体和神经内分泌肿瘤细胞:利用奥曲肽(Octreotide)能够可以和奥曲肽抗体高选择性,高亲和性,特异性结合的特点,GO独特的淬灭效应以及GO,奥曲肽,奥曲肽抗体三者之间相互作用的差异,建立一种简单快速的检测奥曲肽抗体的方法。GO能够吸附荧光标记的奥曲肽并导致其荧光淬灭,从而得到低荧光的复合物,而奥曲肽抗体可以和奥曲肽选择性,特异性结合,从而使其远离GO表面,荧光值得以恢复。另外,我们用大鼠胰腺外分泌细胞(AR42J)代替奥曲肽抗体,进一步研究该传感器在临床肿瘤检测方面的应用价值,该细胞是一种神经内分泌肿瘤细胞,其细胞膜表面过量表达生长抑素受体-2,而奥曲肽可以和生长抑素受体-2高选择性、高特异性、高亲和性结合,同时用一种细胞膜表面不表达该受体的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)做对照,基于上述同样的原理,我们建立了一种简单、快速、灵敏地检测神经内分泌肿瘤细胞的方法。
结果:
1.DNA Origami的分离纯化:我们共分离纯化了两种构型的DNA Origami方块,对于方块1而言,从0.7%的琼脂糖凝胶电泳结果发现:单链,单体,聚体能够很好地分开;而对于方块2,用0.7%的琼脂糖凝胶电泳图上,其单体和聚体都是成弥散状分布没有分开.不管改变什么离心参数之后,其单体和聚体始终黏在一起,整体迁移没有分离效果。
2.DNA Tetrahedron的分离纯化:从10%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果发现,DNA Tetrahedron的单体和聚体始终黏在一起分布于离心管的上部,没有分开,也没有分离的趋势。
3.基于氧化石墨烯(GO)和奥曲肽(Octreotide)构建的纳米传感平台快速、灵敏地检测奥曲肽抗体和检测神经内分泌肿瘤细胞:GO,奥曲肽以及奥曲肽抗体之间相互作用的差异,GO能够吸附荧光标记的奥曲肽的荧光并使其荧光淬灭从而得到低荧光的复合物,当加入奥曲肽抗体后,荧光值恢复,用该方法可以检测到低至2 ng/mL的奥曲肽抗体,灵敏度高、选择性强、重现性好。与此同时我们用大鼠胰腺外分泌细胞(AR42J)代替奥曲肽抗体,用Zeiss荧光显微镜成像观察AR42J细胞膜表面很强的荧光,而CHO细胞膜表面虽然也有部分荧光现象,但其荧光强度明显弱于AR42J细胞。推测可能是因非特异性吸附引起的。当加入GO之后,结果发现,AR42J细胞依然表现很强的荧光,但其荧光强度较弱于未加GO组,而CHO细胞因为细胞膜表面不表达生长抑素受体-2,没有与奥曲肽特异性结合物质,在实验洗涤过程中被洗掉,其荧光显著降低,几乎没有荧光信号,证明了该方法的特异性。
结论:
本论文成功地将具有沉降系数差异的DNA Origami的中的单体和聚体很好的分开,为DNA Origami的进一步研究应用奠定了很好的基础;另外,成功构建了基于氧化石墨烯和奥曲肽的纳米生物传感平台,能够简单、快速、灵敏地检测奥曲肽抗体和大鼠胰腺外分泌细胞,在临床实际工作中有着潜在地应用价值,可以为临床肿瘤患者带来福音,也是医学研究领域的一个新的突破。