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SSR标记是理想的用于植物种质资源遗传多样性分析的DNA分子标记,本文利用公用数据库开发了40对EST-SSR多态性引物。利用其中的25个标记,对中国热带农业科学院橡胶种质圃内保存的289份巴西橡胶栽培种质的遗传多样性进行研究,并初步探寻这些种质组成的遗传结构特性,还构建了巴西橡胶树栽培种质的核心种质库,结果如下:
1、从NCBI数据库中搜索得到巴西橡胶树EST序列11809条(截止2007年5月10日)。在3923条非冗余序列中检索到358个SSRs,即巴西橡胶树SSRs出现的频率为9.1％,表明在橡胶树ESTs中SSRs较为丰富;二核苷酸重复单元占主导地位(57.7％),二核苷酸重复、三核苷酸重复和六核苷酸重复这三种类型的重复最为丰富,共占总SSRs的96.37％;GA/CT、CT/GA、AG/TC和TC/AG在二核苷酸重复中出现的频率分别为24.8％、23.8％、19.9％和18.9％,是二核苷酸重复中含量丰富的位点。
2、设计了158对EST-SSR引物,对48份橡胶树栽培种及近缘种进行扩增后得到60对特异扩增引物,其中40对为多态性引物。用25对多态性引物对289份橡胶树栽培种质进行扩增,能够检测到丰富的稀有等位变异。平均多态信息含量(PIC)、平均期望杂合度(He)和遗传多样性指数(H)的值分别为0.3665、0.4106、0.4098,体现了橡胶树栽培种质整体水平为中度的遗传多样性,同时表明利用EST-SSRs来评价橡胶树遗传多样性是有效和可行的。
3、橡胶树栽培种质个体聚类无典型地域性的特点;具有相同亲本组合的后代,有的聚在一起,而大部分并非聚在一起,呈分散状,分布在系统树的各个分支;群体遗传一致(GI)平均值为0.9103,种质个体间的遗传距离(GD)范围从0到1.1632,均表明种质间的遗传一致度高,亲缘关系近,遗传背景狭窄。
4、检测各群体的25个EST-SSR位点,中国群体有16个、马来西亚群体有12个位点偏离Hardy-Weinberg平衡,印度尼西亚、斯里兰卡、泰国和巴西这四个群体只有极少数位点偏离Hardy-Weinberg平衡状态,印度、X和越南因材料份数少,位点只有单态和Hardy-Weinberg平衡两种状态。这与各群体目前所处的状况及材料份数有关。非随机交配、采样个体间有较近的亲缘关系和选择,尤其是基因流对群体内位点的Hardy-Winbery平衡和遗传结构起作用。
5、300个EST-SSR两两位点组合中有20个(6.67％)个呈显著的连锁不平衡状态,其中有5个(1.67％)呈极显著的连锁不平衡状态,位点20、位点5和位点15这三个位点两两间极显著地处于连锁不平衡,可能是这三个位点的物理距离比较近,也可能为一个连锁群,有待深入研究。所得的结果说明两个位点在特定的群体中是否处于连锁不平衡状态,可以大致体现总群体的连锁不平衡状况,也可以为后续的研究如关联分析等提供参考。
6、群体间基因分化系数(Fst)值0.0541,基因分化系数(Gst)值0.025,AMOVA分析发现2.67％的遗传变异存在于群体间。三种遗传分化分析结果均表明,橡胶树栽培种质群体之间的分化水平低,大部分的遗传变异存在于群体内部。群体间平均基因流(Nm)为4.463,大而通畅的基因流是橡胶树群体间遗传分化水平很低的主要原因,人为选择作用和繁育系统是群体间遗传分化水平低的重要因素,而生境异质性则是引起群体发生轻微遗传分化的原因。
7、GENECLASS、BAPS和STRUCTURE的分群结果表明,总群体内的分化水平低,橡胶树种质总群体中无独立的群体,各个群体是混合的,来自不同国家的橡胶树栽培品种各自具有相对一致、缺乏相对独立的遗传基础。这三个软件的应用,一方面为揭示橡胶树群体真实的遗传结构和群体间亲缘关系提供新的佐证,另一方面将传统的群体遗传学和遗传多样性研究从群体水平深入到个体水平,同时也可以为橡胶选育种过程中亲本组合的选择提供参考依据。
8、构建了由27份典型种质组成的核心种质。核心种质的等位变异及稀有等位基因数达到原本总体种质的100％。27份核心种质互相之间存在生态上和遗传上的距离,覆盖了中国热带农业科学院国家橡胶种质圃内保存的橡胶树栽培品种的遗传变异和生态范围,并尽可能多地保持了原本总体的遗传多样性。可作为我国橡胶树种质资源的高效利用平台,用于优异等位基因资源的发掘与利用,以及作为基础的资源材料,应用于我国橡胶树育种和品种改良。