【摘 要】
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以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)标准菌株HD-1总DNA为模板,通过PCR方法扩增cry1A基因,将PCR回收产物与pMD18-T载体连接,构建克隆重组菌pMD18T-cry1A,经测序
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以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)标准菌株HD-1总DNA为模板,通过PCR方法扩增cry1A基因,将PCR回收产物与pMD18-T载体连接,构建克隆重组菌pMD18T-cry1A,经测序与分析,得到的基因为完整的ORF 3531 bp,编码1176个氨基酸,分子量为133128Da,等电点5.02。通过NCBI BLAST软件分析比对其核苷酸序列,结果显示该基因与cry1Aa1,cry1Ac1均有99%的同源性。经Bt命名委员会命名为新基因cry1Aa21,NCBI登录号为JF699284。将cry1Aa21基因与pET32a表达载体连接,构建BL21-pET32a-cry1Aa21重组菌。SDS-PAGE分析表明目的蛋白为150 kDa左右,其中包含20 kDa左右的HIS标签。提取Cry1Aa21蛋白,以未诱导蛋白和原始菌株HD-1的晶体蛋白为对照,研究对小菜蛾Plutella xylostella (L.)和褐飞虱Nilaparvata lugens (Stal)的生物活性,结果发现Cry1Aa21蛋白和HD-1晶体蛋白对小菜蛾48小时的LC50分别为2.429μg/mL和0.691μg/mL。利用人工饲料膜饲喂法,在72小时内对褐飞虱进行Cry1A蛋白和Bt晶体蛋白的活性验证。在Cry1Aa21蛋白12700μg/mL到0.0127μg/mL的系列浓度下,HD-1在15900μg/mL到0.0159μg/mL的系列浓度下,都对褐飞虱的4、5龄若虫和成虫死亡率无显著影响。Cry1Aa21和HD-1蛋白经胰蛋白酶活化后也对褐飞虱4、5龄和成虫无显著影响。
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