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灵芝是一味珍贵的中药材和食补原料,具有调节人体机能平衡和延年益寿的功效,在我国及其他一些亚洲国家有着悠久的使用历史。自1981年首次报道赤灵芝子实体(G.lucidum)中的阿拉伯木糖基葡聚糖,并证实其具有抗肿瘤活性以来,关于灵芝多糖的研究方兴未艾。黑灵芝是灵芝家族中的重要成员之一,在江西省赣南地区有广泛的种植面积,为当地的经济发展和农民的收入作出了积极的贡献。为了更好的开发和利用黑灵芝资源,本团队针对黑灵芝做了大量工作,现有结果证明黑灵芝子实体中的多糖成分具有显著的免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、改善糖尿病病症等功能,但对于黑灵芝活性多糖的结构基础亟待解决。因此,本文综合采用化学和现代仪器分析方法对黑灵芝子实体多糖的化学结构和溶液构象特征进行表征,采用体外抗氧化和细胞免疫模型对黑灵芝活性多糖的构效关系进行初步探讨。现将主要研究结果归纳如下:(1)建立了热水和碱液分步萃取黑灵芝多糖的系统方法,得到黑灵芝水溶性(PSG)和水不溶性(AGAP)多糖组分,成分分析表明PSG主要成分为多糖(中性糖和糖醛酸),含量一定量的蛋白质和酚类物质;而AGAP则为高纯度的多糖类物质,糖含量达98.9%。为了提高提取效率,采用响应面法优化得到了超声波辅助萃取PSG的最佳条件:料液比34 mL/g、提取时间51 min、提取温度60℃,在此条件下PSG的得率为1.03%;与传统热水提取比较,超声波辅助提取能有效提高多糖的提取效率和改善多糖的理化性质。建立了分子排阻色谱(SEC)结合阴离子交换色谱(AEC)的PSG分级体系,制备得到两种水溶性多糖级分PSG-1-F0.2和PSG-2。(2)采用部分酸水解、甲基化分析和1D/2D NMR技术对PSG-1-F0.2的化学结构进行表征,证明PSG-1-F0.2为高支化的酸性β-(1→3,1→6)-葡聚糖,推断了 PSG-1-F0.2中的两个基本结构片断:β-(1→3)-葡聚糖片断(G13)和β-(1→6)-葡聚糖片断(G16):然而,关于G13和G16片断在PSG-1-F0.2糖链中的分布和比例还有待于进一步探讨。(3)采用红外光谱(FT-IR)、甲基化、1D/2D NMR波谱和高效分子排阻色谱(HPSEC)等技术对PSG-2的化学结构和分子质量(Mw)进行分析,表明PSG-2是一种低支化的α-(1→6)-半乳聚糖类多糖,在半乳糖的O-2位置出现支链,Mw为16.10 KDa,推测其重复单元结构如下:其中,R 可能是以下几个片段之一:T-α-D-Galp-(1→6)-2-OAc-α-D-Galp-(1→,T-α-D-Galp-(1→6)-α-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→,T-α-D-Galp or T-α-D-Manp.(4)采用动静态光散射(DLS,SLS)和HPSEC技术,结合高分子稀溶液理论对PSG-1-F0.2的溶液构象特征进行了探讨,结果表明:PSG-1-F0.2在水中会形成大的聚集体,0.9%NaCl溶液可以消除聚集体的形成,得到单分子分布的溶液;PSG-1-F0.2在0.9%NaCl溶液中的分子参数为Mw12.73 KDa、呈多分散体系、特性粘度[η]为0.09 dL/g、回旋半径(Rg)为17.1 nm、流体力学半径(Rh)为8.1 nm、无尺寸速率ρ(Rg/Rh)为2.11,结合Mw与[η]、Rg和Rh之间的关系,证明PSG-1-F0.2在0.9%NaCl溶液中呈高支化的紧凑卷曲线团,该构像特征与PSG-1-F0.2中的G16结构片断有着紧密的联系;原子力显微镜(AFM)观察到了 PSG-1-F0.2的聚集现象和球形结构,扫描电镜(SEM)表明PSG-1-F0.2呈高支化的多孔蓬松固体形态,透射电镜(TEM)表明PSG-1-F0.2在水溶液中的聚集现象可能与多糖链的自组装过程有关。(5)根据PSG的多糖性质和AEC的分级原理,建立了 PSG的高效分级体系,得到了中性多糖Fw、酸性多糖(F0.2和F0.5)以及蛋白与酚类级分(F2);通过单糖组成、甲基化和13CNMR波谱证明Fw为α-(1→6)-半乳聚糖类杂多糖(PSG-2),而F0.2为酸性β-(1→3,1→6)-葡聚糖类多聚糖(PSG-1-F0.2),该结果表明AEC法可取代SEC法应用于PSG的高效分级;通过体外抗氧化和细胞免疫模型筛选了 PSG的活性级分,证明PSG良好的抗氧化活性主要归功于交联在多糖上的酚类和蛋白,而其免疫活性主要富集在酸性多糖组分(F0.2和F0.5),其中β-(1→3,1→6)-葡聚糖成分对免疫活性的发挥起到关键作用。(6)采用甲基化、1D/2D NMR波谱和静态光散射技术对水不溶性多糖AGAP的结构进行了表征,通过氯磺酸/吡啶法对AGAP进行硫酸化修饰。结果表明:AGAP是一种低支化的α-(1→3)-葡聚糖,支链点出现在O-6位置上,端基由木糖和甘露糖组成,Mw为1,665 KDa,Rg为65.49 nm;硫酸化修饰得到不同酯化度(DS)的衍生物(按DS由低到高分别记为S-1,S-2和S-3),理化性质分析表明这些衍生物的水溶解性和流变特性得到显著改善、Mw降低、溶液分子刚性增强,体外活性分析表明硫酸化衍生物的抗氧化活性和对S-180肉瘤细胞的细胞毒性显著提高,酯化度最高的S-3(DS=1.14)生物活性最佳;通过对S-3的结构表征证明:S-3保留了 AGAP的结构特征,非选择性的硫酸化反应主要发生在AGAP的葡萄糖残基O-6位置,部分发生在O-2和O-4位置。综上,本研究较为完整地解析了黑灵芝子实体中的酸性β-葡聚糖类(PSG-1-F0.2)、中性α-半乳聚糖类(PSG-2)和水不溶性α-葡聚糖类(AGAP)多糖的结构特征。其中PSG良好的免疫调节活性与其酸性β-(1→3,1→6)-葡聚糖的结构以及高支化的紧凑卷曲构象有关;PSG良好的抗氧化活性则主要归功于其中的酚类物质和交联蛋白成分,与多糖成分无相关性。而硫酸化修饰水不溶性多糖AGAP的研究将为黑灵芝高附价值副产物的开发和利用提供一种新思路。