【目的】建立大鼠胫骨牵张成骨模型,研究大鼠牵张成骨模型中,内皮祖细胞的动员情况,即内皮祖细胞在外周血中的表达变化;以骨折愈合作为对照,主要研究牵张成骨动物模型牵张区域血流灌注情况以及通过HE染色观察血管面积以及数量,结合检测骨折断端区域SDF-1α、CXCR-4以及下游MAPK信号通路的表达情况,揭示内皮祖细胞在牵张成骨中的血管促进功能、动员机制,及过程中SDF-1α/CXCR4轴MAPK信号通路所起到的重要作用;体外分离培养EPCs细胞,研究内皮祖细胞的体外定向迁移和分化成血管方面SDF-1α/CXCR4反应轴所起的重要作用。【方法】第一部分:选取2月龄雄性SD大鼠,分为骨折对照组和牵张成骨实验组进行骨折及牵张成骨造模。分别于截骨前,及截骨后每3天每组动物处死5只进行麻醉取外周血,分离内皮祖细胞并通过流式细胞术进行鉴定和表达水平分析。第二部分:选取2月龄雄性SD大鼠,分为骨折对照组和牵张成骨实验组进行骨折及牵张成骨造模。(1)分别于截骨后的第13天和第16天,骨折组和牵张组各取5只大鼠,将所有动物麻醉,进行灌注实验操作,灌注完成后,将标本脱钙处理。脱钙后将标本进行Micro-CT扫描,获取Micro-CT图像。扫描结束后,利用软件计算血管数量,血管厚度,血管体积/总体积和血管间隙。(2)分别应用激光多普勒血流测量仪对截骨后第10天,第13天和第16天的牵张组和骨折对照组实验动物进行血流量检测。(3)分别于截骨后的第7天,第10天,第13天,第16天,第19天和第21天,骨折组和牵张组各取5只大鼠,将所有动物麻醉,处死后将骨标本进行固定,固定完成后进行脱钙,脱钙进行4周后进行脱水、包埋和切片。切好的片子进行SDF-1α抗体孵育显色,进行免疫组化分析。(4)提取骨痂中的总RNA,反转录成c DNA,定量PCR实验检测骨痂中的SDF-1α/CXCR4表达水平。(5)大鼠骨痂组织提取全蛋白Western blot检测p38,JNK,ERK及各自的磷酸化产物p-p38,p-JNK,p-ERK,CXCR4和βactin的表达水平。第三部分:选取雄性SD大鼠,提取分离骨髓中的内皮祖细胞,并进行培养和鉴定。(1)培养好的细胞首先通过Transwell小室细胞迁移实验,了解因子SDF-1α/CXCR4对内皮祖细胞的迁移能力影响,加入因子SDF-1α观察细胞迁移数量,加入CXCR4抑制剂AMD3100验证迁移影响的特异性。(2)培养好的细胞通过加力实验观察加力对血管分化的作用,收集加力后的细胞,提取细胞总RNA,通过RT-PCR检测细胞中SDF-1α/CXCR4的基因表达水平,同时提取细胞总蛋白,通过Western-blot检测细胞中SDF-1α/CXCR4的蛋白表达水平,通过因子水平分析细胞分化过程中SDF-1α/CXCR4所起的重要作用。【结果】第一部分:(1)在骨折对照组模型中,外周血中内皮祖细胞的数量随着截骨的发生而出现暂时升高,与截骨前比较,截骨第3天后,外周血中的内皮祖细胞的数量达到峰值,随后逐渐降低。(2)与同期骨折组相比,牵张后EPCs(包括成熟和不成熟)数量增加,差异有统计学意义(P<0.05),在巩固期两组差异无统计学意义。(3)骨折后CD133阳性细胞数持续下降,这表明不成熟EPCs向成熟EPCs转化增加,而牵张过程中不成熟EPCs数量增加。(4)骨折后CD34阳性细胞有上升趋势,表明在单个核细胞群体中,干细胞数量增加,而牵张过程中CD34阳性细胞数量也较骨折组数量增加。第二部分:(1)Microfil结果显示,与对照骨折组相比,牵张组在截骨后的第13天和16天形成较多的血管,表现为截骨端生成更多的血管,血管密集分布在截骨端。Micro-CT扫描结果显示,在第16天时牵张组血管体积比高于骨折组,差异有统计学意义,而血管数量在Microfil灌注上并无统计学意义。(2)血流测定结果显示骨折侧血流量要高于对侧血流量;牵张侧的血流量明显高于对侧;牵张较单纯骨折可以增加骨折断端血流量。(3)观察骨折组和牵张组动物截骨后的第7天,第10天,第13天,第16天和第19天骨痂处血管形成情况。表明随着骨折时间的延长,骨折组和牵张组骨痂处血管数量均出现逐渐减少;牵张组血管数量以及血管面积明显高于骨折组,在巩固期血管数量较牵张期减少。牵张期开始后显著提高了血管数量,且随着骨折时间延长,血管数量在牵张组以及骨折组均降低,但是牵张组高于骨折组,在16天内差异均有统计学意义(P<0.05);对于血管面积,牵张组随着时间延长有缓慢上升趋势,骨折组血管面积开始缓慢下降,牵张组血管面积高于骨折组,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)随着骨折时间的延长,骨痂处血SDF-1α的表达量逐渐减少;牵张组SDF-1α的表达量要高于同时期骨折组,但是在巩固期后呈现下降趋势。(5)RT-PCR对实验全程不同时间点的骨折组和牵张组动物骨痂中SDF-1α和CXCR4的表达水平进行分析。表明骨折后随着时间的增加,SDF-1α表达量增加,骨折术后1天、3天以及5天SDF-1α差异并无统计学意义(P>0.05)。但牵张后,牵张组相对骨折组可以增加SDF-1α的表达量,在术后13天达到峰值,然后随时间降低,骨折后19天以及21天差异无统计学意义(P>0.05),21天恢复到骨折对照组水平。对于CXCR4,相对于未截骨对照,骨折和牵张均不同程度的使其表达水平上升,但是除了牵张组CXCR4的表达水平在19天时高于骨折组(差异有统计学意义(P<0.05))外,其余时间点牵张组和骨折组未见明显差异。(6)蛋白Western blot检测发现骨折愈合过程中p-p38的水平逐渐降低,p-38水平逐渐升高,与骨折组比较,牵张组可以增加p38,JNK以及ERK的磷酸化水平。第三部分:(1)内皮祖细胞的迁移随因子SDF-1α浓度升高显著增加(P<0.05)。5μg/m L CXCR4抑制剂AMD3100显著降低了迁移数量(P<0.05)。(2)细胞分化成血管的面积和长度均在加力后显著增加(P<0.05)。且与对照组比较,加力组细胞的因子SDF-1α和CXCR4表达水平显著提高(P<0.05)。【结论】(1)实验结果发现,骨折过程中外周血中内皮祖细胞的数量有所增加,但是,相对其而言,在牵张成骨过程中外周血中内皮祖细胞的数量在牵拉期和巩固期都有更高数量的增加。说明牵张成骨过程诱导了内皮祖细胞由骨髓动员至外周血,并且存在特殊的动员机制。(2)牵张成骨过程中,牵拉较骨折过程血管数量、血管面积和血流量均有不同程度的增加,具有更多的血管生成和更大的血管新生面积。牵张成骨过程中存在大量内皮祖细胞的动员和促血管行为。而这种动员是区别于普通的骨折愈合过程的,同时我们发现在牵张成骨过程中,不同的阶段其动员能力,即血管生成面积和数量也有所不同,总体而言在牵张期要较巩固期高些,这或许是因为牵张期的损伤程度更大,伴随的血管再生也更多。(3)在整个骨折愈合和牵张成骨过程中,SDF-1α和CXCR4的表达水平在全部时间范围内呈现出了先上升后下降的趋势,上升主要出现在前期的截骨期,截骨刺激机体导致SDF-1α和CXCR4迅速上升,趋势与内皮祖细胞的动员趋势大致相同,是SDF-1α和CXCR4与内皮祖细胞动员相关性的强烈证明;相对单纯骨折而言,牵张成骨过程中内皮祖细胞大量动员至外周血,参与血管生成,与SDF-1α和CXCR4的轴反应有密切相关性。巩固期的SDF-1α和CXCR4表达水平较牵拉期低,与前述血管血流结果类似,同样反应了牵张期的剧烈损伤程度。(4)与骨折组比较,牵张组可以增加p38,JNK以及ERK的磷酸化水平,提示我们在牵张过程中可能通过MAPK信号通路进行信号传导,促进细胞功能。(5)SDF-1α促进了内皮祖细胞的体外迁移,且受到AMD3100抑制调解。(6)我们同时发现内皮祖细胞的分化成血管能力可能受到因子SDF-1α/CXCR4调节。表现为细胞加力后成管面积和长度增加,加力细胞中SDF-1α/CXCR4表达水平提高。