背景急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死,是心血管疾病患者死亡的重要原因。经皮冠状动脉介入等治疗手段虽然能及时挽救患者生命,但由于梗死区域的心肌细胞大量丢失且不可逆,患者发生心肌重构并逐步进展为心力衰竭(heartfailure,HF),严重影响了心肌梗死患者的远期预后。因此,寻找心脏损伤修复过程中新的干预靶点并开发有效的内源性心肌保护因子意义重大。外泌体(exosome)是由细胞分泌的、直径30-100nm、包含蛋白质、脂质、核酸等生物活性物质的囊状小泡。外泌体可通过将内容物释放至受体细胞或通过“受体-配体”机制调节受体细胞功能。因此,外泌体在旁分泌以及不同组织细胞间的信息交流中发挥了重要作用。血液因其外泌体含量较高,加上容易获取、取材便利,血液来源外泌体受到了研究者的广泛关注。近年来有数项研究报道了健康人血浆外泌体在心脏保护方面的作用,但AMI恢复期患者血浆外泌体是否仍有保护作用及保护效能是否变化尚不清楚。深入研究急性心肌梗死恢复期这一病理条件下血浆外泌体的生物学效能,对多角度理解心脏损伤后自我修复的机制具有重要意义,同时也有利于寻找心脏损伤修复过程中新的干预靶点。第一部分AMI恢复期患者及健康人血浆外泌体的表征和特性分析目的:收集AMI恢复期患者及健康人的血液标本,提取血浆外泌体,观察其表征及特性。方法:1.透射电镜对两组血浆外泌体进行形态学鉴定;2.纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术分析两组血浆外泌体粒径分布和数量;3.Western blot检测两组血浆外泌体标记蛋白;4.倒置荧光显微镜观察PKH26标记的血浆外泌体被细胞摄取及其在细胞间传递的特性。结果:1.两组血浆外泌体的形态、浓度及粒径分布、标记蛋白表达等表征均无显著差异。2.血浆外泌体均可被体外或在体心肌细胞摄取、摄取过程是发动蛋白(Dynamin)依赖的。3.血浆外泌体可在细胞间传递。结论:AMI恢复期患者与健康人血浆外泌体的表征和特性无明显差异。第二部分AMI恢复期患者及健康人血浆外泌体对心脏损伤修复的作用比较目的:通过建立H2O2诱导的心肌细胞氧化损伤模型及大鼠心肌梗死模型,比较AMI恢复期患者血浆外泌体(AMI-Exo)与健康人血浆外泌体(Nor-Exo)对心脏损伤的修复作用是否存在差异,同时观察两者对心肌细胞凋亡和自噬的影响。方法:1.体外实验中,分别使用Nor-Exo和AMI-Exo预处理H9c2心肌细胞后加入H2O2诱导心肌细胞氧化损伤,处理结束后用CCK-8法检测心肌细胞活力,流式细胞术、Western blot及TUNEL免疫荧光实验检测心肌细胞凋亡水平,用Western blot、mRFP-GFP-LC3双标荧光、电镜检测心肌细胞自噬活性;2.在体实验中,采用大鼠冠脉左前降支结扎法建立急性心肌梗死模型,以多点注射方式向大鼠左室心肌内注射Nor-Exo或AMI-Exo或PBS,假手术组仅穿线不结扎。心肌梗死后28天行心脏超声检测大鼠心功能,其后处死大鼠、收集心脏组织标本行Masson染色、TUNEL免疫荧光染色及电镜观察,以明确心肌梗死及纤维化、心肌细胞凋亡及自噬水平。结果:1.体外实验中,Nor-Exo和AMI-Exo均可在H2O2处理条件下增强细胞活力、减少细胞凋亡、抑制细胞过度自噬,但AMI-Exo的上述作用均弱于Nor-Exo。2.体内实验中,Nor-Exo和AMI-Exo心肌注射均可减小大鼠AMI后心肌梗死面积、改善心功能,并抑制心肌细胞凋亡和自噬,但同样AMI-Exo的上述作用均弱于Nor-Exo。结论:AMI恢复期患者血浆外泌体对心脏损伤的修复作用弱于健康人血浆外泌体,且两者修复作用的机制可能与抑制心肌细胞凋亡和过度自噬有关。第三部分AMI恢复期血浆外泌体miR-342-3p失调对心脏损伤修复的影响研究目的:利用miRNAs测序结果、qRT-PCR验证及初步功能筛选,确定AMI-Exo中发生失调的关键miRNA。其后,在H2O2诱导的心肌细胞氧化损伤模型及大鼠心肌梗死模型上明确该miRNA对心脏损伤修复的影响。方法:1.采用高通量测序技术对Nor-Exo和AMI-Exo包含的miRNAs进行测序,根据测序结果对差异变化较大的miRNA进行qRT-PCR验证,其后利用CCK-8法对明确差异表达的miRNA进行功能筛选,从而确定发挥作用的关键分子;2.体外实验中,将关键miRNA mimic及其阴性对照转染入H9c2心肌细胞中,后加入H2O2诱导心肌细胞氧化损伤,处理结束后用CCK-8法检测心肌细胞活力,流式细胞术、Western blot及TUNEL免疫荧光实验检测心肌细胞凋亡水平,用Western blot、mRFP-GFP-LC3双标荧光、电镜检测心肌细胞自噬活性;3.在体实验中,首先利用电穿孔法将关键miRNA mimic及其阴性对照转染入AMI-Exo。其后,建立大鼠急性心肌梗死模型,以点注射方式向大鼠左室心肌内注射关键miRNA过表达的AMI-Exo或转入阴性对照的AMI-Exo。心肌梗死后28天行大鼠心脏超声检测心功能,其后处死大鼠、收集心脏组织标本行Masson染色、TUNEL免疫荧光染色及电镜观察,以明确心肌梗死及纤维化、心肌细胞凋亡及自噬水平。结果:1.与 Nor-Exo 相比,AMI-Exo 中 miR-342-3p水平降低。2.体外实验中,与阴性对照相比,向心肌细胞中转染miR-342-3p mimic,可在H2O2处理条件下增强细胞活力、减少细胞凋亡、抑制细胞过度自噬。3.体内实验中,与阴性对照相比,转染miR-342-3p mimic的AMI-Exo显著减小大鼠AMI后心肌梗死面积、改善心功能,并显著抑制心肌细胞凋亡和自噬。结论:AMI恢复期血浆外泌体心脏损伤修复作用减弱主要来源于miR-342-3p的低表达。第四部分 miR-342-3p调控靶基因在心肌细胞凋亡和自噬中的作用研究目的:利用生物信息学对miR-342-3p的靶基因进行预测,结合既往文献报道,挑选与细胞凋亡和自噬通路有关的基因进行靶向验证及功能验证。方法:1.使用 miRNA 靶基因数据库 miRanda,miRDB 和 TargetScan对 miR-342-3p的潜在靶基因进行预测。根据预测结果并结合文献分析,选取SOX6和TFEB作为候选靶基因;2.利用Western blot及双荧光素酶报告基因系统对miR-342-3p与SOX6、TFEB的靶向关系进行验证;3.将SOX6过表达质粒pcDNA3.1-SOX6或空载对照质粒pcDNA3.1与miR-342-3p mimic或其阴性对照mimic-NC共转染到H9c2心肌细胞中,然后加入H2O2诱导细胞损伤。处理结束后,Western blot检测SOX6蛋白水平,CCK-8法检测细胞活力;4.将TFEB小干扰RNA(TFEB SiRNA)及其阴性对照(NC SiRNA)转染到H9c2心肌细胞中,然后加入H2O2诱导细胞损伤。处理结束后,Western blot检测TFEB蛋白及自噬相关蛋白LC3的表达水平。结果:1.miR-342-3p直接靶向SOX6,向心肌细胞转染miR-342-3pmimic的同时过表达SOX6抵消了 H2O2处理条件下miR-342-3p的细胞保护作用。2.miR-342-3p直接靶向TFEB,向心肌细胞转染TFEB SiRNA进行干扰,明显抑制了 H2O2诱导的细胞自噬。结论:miR-342-3p分别通过靶向SOX6及TFEB抵抗H2O2诱导的心肌细胞凋亡和自噬。