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钙离子是植物中的第二信使,它参与调节植物的生长发育以及生物和非生物胁迫反应。而类钙调神经素B亚基蛋白(CBL)被认为是植物特异性钙信号传导途径中至关重要的Ca2+传感器。目前为止,本课题组已从林烟草中鉴定到12个CBL蛋白。本研究构建了林烟草NsylCBL4、NsylCBL6的过表达材料并进一步探究了NsylCBL4和NsylCBL6两个基因的功能,主要获得以下结果:(1)蛋白序列分析:NsylCBL4的CDS序列编码234个氨基酸,其氨基酸序列中具有三个Ca2+结合基序的功能性EF手型结构。NsylCBL6的CDS序列编码211个氨基酸,其氨基酸序列中具有三个EF手型结构。另外,NsylCBL6蛋白序列与拟南芥AtCBL7蛋白序列有高度相似性,约71.35%,与杨树PeCBL3蛋白序列的相似性为72.51%。(2)基因过表达材料的获得:通过农杆菌介导的叶盘转化法将NsylCBL4转入烟草中,通过半定量PCR筛选出目标基因的低表达和高表达株系。在24个株系中,选择15号和24号株系的T2代材料进行功能分析。通过浸花法将NsylCBL6基因转入拟南芥中。通过基因组PCR检测T1代,通过半定量和荧光定量PCR进一步确认。此外,还进行了抗性筛选方法以进一步选择纯合的T2和T3株系,并收集了T3种子用于NsylCBL6的功能分析。(3)NsylCBL4对叶片发育的影响及对渗透胁迫的响应:NsylCBL4过表达使得转基因烟草叶片形态改变,具体表现为株高降低,叶片狭窄。且使得表皮细胞层浓缩从而增加了叶片叶绿素含量并影响了光合作用速率。且观察表明,转基因株系在400和500mm山梨醇培养基上的叶片形态差异显著,叶片圆盘上有明显变化,转基因株系对渗透胁迫更敏感。(4)NsylCBL6与植物根部硝酸盐信号转导:在低NO3~-胁迫下,NsylCBL6基因的过表达使得转基因拟南芥侧根数增多且根伸长。因此NsylCBL6可能参与拟南芥根部的硝酸盐信号通路。综上,推测NsylCBL4是影响叶片生长发育和渗透胁迫响应的重要基因,而NsylCBL6是参与硝酸盐信号转导的关键基因。上述工作为CBL基因家族在植物生长发育和非生物逆境胁迫响应的研究提供了更多数据支持。