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肠炎沙门菌是一种重要的食源性病原菌,宿主谱广泛且具有侵害性,具有重要的公共卫生意义。利用抗生素治疗虽能达到一定的效果,但极易导致多重耐药菌株的产生及肉产品中的药物残留。因此,研制出安全、有效的疫苗是预防和控制畜禽肠炎沙门菌病的有效措施。随着基因工程和分子生物学技术的发展,将沙门菌的重要毒力基因敲除,构建沙门菌减毒活疫苗的研究得到了国内外的广泛关注。减毒活疫苗具有使用方便、免疫原性好、毒力弱等优点,即使在“免疫空白期”也能产生良好的免疫保护力。此外,通过基因敲除可获得血清学上的阴性标记,建立区分野毒感染和疫苗接种动物的(Differentiating Infected and Vaccinated Animals,DIVA)检测方法,从而为养殖与生产过程区分疫苗接种动物和野生型细菌感染动物提供依据。本研究联合应用λ-Red同源重组系统和自杀质粒介导的同源重组方法,分别将肠炎沙门菌CZ14-1的毒力相关基因spiC和外膜蛋白相关基因nmpC以及脂多糖O-抗原链合成相关基因rfaL敲除,在构建CZ14-1AspiC单缺失株的基础上构建了两株双基因缺失株CZ14-1ΔspiCΔnmpC与CZ14-1ΔspiCΔrfaL,并评价了两株双基因缺失株生理生化特性以及对不同品种雏鸡的致病性,同时对双缺失株的免疫保护效力进行了初步探究,为肠炎沙门菌减毒活疫苗的研究提供了材料和依据。1.减毒肠炎沙门菌CZ14-1ΔspiCAnmpC与CZ14-1ΔspiCΔrfaL缺失株的构建与鉴定以肠炎沙门菌CZ14-1为模板,通过重组自杀质粒pGMB152-ΔspiC/Cm介导的同源重组系统,敲除肠炎沙门菌CZ14-1的spiC基因,成功构建CZ14-1ΔspiC缺失株。随后利用PCR技术扩增出两端与肠炎沙门菌基因nmpC上、下游序列同源且中间为氯霉素抗性基因的DNA片段和两端与肠炎沙门菌基因rfaL上、下游序列同源且中间为氯霉素抗性基因的DNA片段,电击转化入含有质粒pKD46的CZ14-1ΔspiC中,分别获得替换nmpC和rfaL的阳性克隆(CZ14-1ΔspiCΔnmpC::cat和CZ14-1ΔspiCΔrfaL::cat),再电转入温度敏感性型质粒pCP20以消除氯霉素抗性基因,通过PCR以及测序鉴定,成功构建了肠炎沙门菌双基因缺失株 CZ14-1ΔspiCΔnmpC和CZ14-1ΔspiCΔrfaL。对野生株CZ14-1和缺失株CZ14-1ΔspiCΔnmpC、CZ14-1ΔspiCΔrfaL的体外生长特性、生化特性进行鉴定,结果表明,spiC和nmpC基因的缺失对细菌的生长特性和生化特性无显著影响,但是rfaL基因的缺失会使细菌的生长速度减缓,并且对甘露醇的代谢能力发生了变化。2.减毒肠炎沙门菌CZ14-1ΔspiCΔnmpC和CZ14-1ΔspiCΔrfaL缺失株免疫保护效力的初步研究动物实验结果显示:肠炎沙门菌CZ14-1ΔspiCΔnmpC在3日龄海兰白蛋鸡上的LD50为1.58 X 107CFU,细菌CZ14-1ΔspiCΔrfaL在3日龄海兰白蛋鸡上的LD50为7.76 ×106CFU。与野生株CZ14-1的LD50相比(约为2.24× 104CFU),毒力约下降了 705倍和346倍。细菌CZ14-1ΔspiCΔnmpC在3日龄SPF雏鸡上的LD50为2.57 × 107CFU,细菌CZ14-1ΔspiCΔrfaL在3日龄海SPF雏鸡上的LD50为4.07× 106CFU。与野生株CZ14-1的LD50相比(约为1.26× 104CFU),毒力分别约下降了 2030倍和323倍。与野生株相比,在不同品种的雏鸡上,两株双缺失株的毒力均明显下降。将缺失株CZ14-1ΔspiCΔnmpC和CZ14-1ΔspiCΔrfaZ分别以肌肉注射的途径免疫7日龄的海兰白雏鸡,在14日龄时进行二次免疫,10天后以肌肉注射的方式人工感染野生型菌株 CZ14-1,剂量为 2.0 X 109CFU/只。结果显示,CZ14-1ΔspiCΔnmpC 和 CZ14-1ΔspiCΔrfaL能够对野生株的大剂量攻毒分别产生80%和75%的保护力,未免疫组的存活率仅有5%;且免疫组体重净增量也较未免疫组有明显提高。在体内分布与定植试验中,将野生株和2株双缺失株以肌肉注射的方式接种3日龄的海兰白雏鸡,在肝脏和回肠内,两株缺失株在接种后21天被机体清除。利用间接ELISA检测血清中的IgG抗体,结果显示,两株缺失株在免疫后1周即可在血清中检测到IgG抗体,抗体水平在随后的数周逐渐上升并在免疫后第5周达到高峰。荧光定量PCR检测CZ14-1Δsp/CΔnmpC和CZ14-1ΔspiCΔrfaL在免疫过程中脾脏细胞因子的表达结果显示:与对照组相比,IFN-γ和IL-6表达水平显著上调,表明两株双缺失株都能引起强烈的Th1倾向的免疫应答,有助于胞内沙门菌的清除。以SpiC蛋白作为包被抗原进行间接ELISA检测,可以明显的区分出野生株感染和两株双缺失株接种的鸡。通过玻板凝集试验(SPA)可以明显区分野生株感染和CZ14-1ΔspiCΔrfaL缺失株接种的鸡,说明两株双缺失株都具有DIVA能力,可以利用不同的方法区分出疫苗接种动物和野毒感染动物。以上结果显示,两株双缺失株不仅具有良好的安全性,并且能针对野生型毒株的高剂量攻毒提供较好的保护和DIVA能力,为将其开发成为肠炎沙门菌减毒活疫苗候选株奠定了基础。