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目的:考察氧化苦参碱(OMT)对大、小鼠神经病理性疼痛镇痛中对动物步态行为的改善作用,进一步明确N-、L-型钙通道介导的OMT对神经病理性疼痛的镇痛作用。材料与方法:1.坐骨神经部分结扎法(PSNL)建立神经病理性疼痛小鼠PSNL模型;脊神经结扎法(SNL)建立神经病理性疼痛大鼠SNL模型。2.利用CatWalk步态分析仪对神经病理性疼痛模型小鼠的自然步态指标采集分析,评估步态行为参数变化的时间-效应关系,参数包括:坐骨神经功能指数(Sciatic Functional Index,SFI)、足印长度(Print Length)(cm)、足印宽度(Print Width)(cm)、足印面积(Print Area)(cm~2)、最大接触时间的足印面积(Max Contact Area)(cm~2)、站立时间(Stands)(s)、单足接触时间(Single Stance)(s)、最大接触时间的最大强度(Max Contact Max Intensity)、完整足印的平均强度(Mean Intensity)、正常步序比(Regularity Index)、摆动时间(Swing)(s)、步周长(Stride Length)(cm)、身体速度(Body Speed)(cm/s)。3.利用CatWalk步态分析仪对神经病理性疼痛模型实验鼠的自然步态的多项指标进行采集,分析假手术Sham组、PSNL模型组、OMT给药组实验鼠步态行为方式的变化,以及OMT对该改变的影响和纠正作用。4.利用Fluo-3AM荧光探针法测定原代培养的小鼠背根神经节(DRG)细胞内钙离子浓度,组别如下:Control组、Sham组、OMT组、Nif组、CTX组、OMT+Nif组、OMT+CTX组、L-Type CC Agonist组、N-Type CC Agonist组、L-Type CC Agonist+OMT组、N-Type CC Agonist+OMT组、PSNL组、OMT+PSNL组、Nif+PSNL组、CTX+PSNL组、Nif+OMT+PSNL组、CTX+OMT+PSNL组,比较OMT与N-、L-型钙通道阻断剂对PSNL小鼠DRG细胞内钙离子浓度影响以及比较N-、L-型钙通道激活剂对正常小鼠DRG细胞内钙离子浓度改变情况。5.利用酶联免疫分析(ELISA)试剂盒检测N-、L-型钙通道介导的氧化苦参碱对小鼠神经递质/肽、细胞因子含量变化的影响。6.利用CatWalk步态分析仪对神经病理性疼痛模型小鼠的自然步态指标采集,分析OMT+CTX给药组、OMT+Nif给药组对PSNL小鼠的步态行为方式的改变,比较OMT与CTX、Nif对神经病理性疼痛小鼠的步态参数的影响相似性。结果:1.神经病理性疼痛模型小鼠步态行为的时间-效应关系研究PSNL小鼠的坐骨神经功能指数(SFI)在PSNL Day1、3、7、14、21显著下调(P<0.05)。手术侧后足(LH)中,与Day 0相比,各时间点PSNL模型组的足印长度、足印宽度、足印面积、最大接触时间的足印面积等足印相关的四项指标与站立时间、单足接触时间、最大接触时间的最大强度、完整足印的平均强度等平衡相关的四项均显著下调(P<0.05),正常步序比、步周长、摆动时间、身体速度等身体协调性相关的四项中,差异无统计学意义(P>0.05)。2.CatWalk步态分析法检测OMT对神经病理性疼痛小鼠步态行为分析指标的影响利用PSNL Day7小鼠作为模型小鼠,与PSNL模型组相比,OMT给药组使SFI显著上调(P<0.01);手术侧后足(LH)与足印相关的四项指标中,与PSNL模型组相比,OMT给药组参数显著上调(P<0.05);身体协调性相关的四项指标均未见显著变化(P>0.05)。手术对侧前足(RF)与手术侧后足(LH)的足印相关四项指标变化相反,并有统计学意义(P<0.05)。3.CatWalk步态分析法检测OMT对神经病理性疼痛大鼠步态行为的改善情况SNL模型组大鼠的坐骨神经功能指数SFI显著下调(P<0.01);OMT使SNL大鼠的SFI显著上调(P<0.01);SNL模型组的LH侧的足印相关四项指标及平衡相关四项指标均显著下调(P<0.01),OMT给药组较SNL模型组大鼠的平衡相关四项指标参数显著上调(P<0.05),身体协调性相关四项指标没有改变(P>0.05)。4.N-、L-型钙通道介导的OMT对培养的PSNL小鼠DRG细胞内钙离子浓度的影响与Sham假手术组比较,PSNL模型组中DRG神经元细胞的钙离子浓度显著上调(P<0.01);OMT给药组、Nif给药组、CTX给药组、OMT+Nif给药组、OMT+CTX给药组均显著抑制PSNL小鼠DRG神经元钙离子浓度的上调。低剂量与高剂量的N-Type CC Agonist、L-Type CC Agonist使细胞内钙离子浓度显著升高(P<0.01),OMT显著抑制了N-Type CC Agonist(P<0.01)和L-Type CC Agonist(P<0.05)引起的钙离子浓度变化。5.N-、L-型钙通道介导的OMT对神经递质/肽含量变化的影响脑组织中,PSNL小鼠OMT、N-型钙通道阻断剂CTX和L-型钙通道阻断剂Nif单独给药以及OMT合并钙通道阻断剂给药均使PSNL带来的GABA及5-HT的变化出现显著逆转;同时,分别合用N-、L-型钙通道阻断剂则显著加强了OMT对PSNL引起GABA和5-HT水平变化的抑制作用。脊髓组织中,PSNL小鼠OMT、N-型钙通道阻断剂CTX和L-型钙通道阻断剂Nif单独给药及OMT合并钙通道阻断剂给药均使PSNL带来的GABA及5-HT的变化出现显著逆转,合并OMT与钙通道阻断剂给药,p-物质的变化出现显著逆转(P<0.05);同时,分别合用N-、L-型钙通道阻断剂则显著加强了OMT对PSNL引起GABA水平变化的抑制作用(P<0.01)。DRG组织中;PSNL小鼠OMT、N-型钙通道阻断剂CTX和L-型钙通道阻断剂Nif单独给药以及OMT合并钙通道阻断剂给药均使PSNL带来的GABA、5-HT及p-物质的变化出现显著逆转。同时,OMT与N-型钙通道阻断剂合用显著加强了OMT对PSNL引起GABA水平变化的抑制作用(P<0.05)。6.N-、L-型钙通道介导的OMT对细胞炎性因子IL-1β和缺氧诱导因子HIF-α含量变化的影响脑组织中,PSNL小鼠的IL-1β水平显著升高(P<0.01),OMT、N-型钙通道阻断剂CTX和L-型钙通道阻断剂Nif单独给药以及合并OMT与钙通道阻断剂给药均使PSNL带来的IL-1β的变化出现显著逆转;HIF-α水平未受到各组给药的影响。脊髓组织中,PSNL小鼠的IL-1β和HIF-α水平显著升高(P<0.05),除L-型钙通道阻断剂Nif单独给药外,OMT、N-型钙通道阻断剂CTX以及合并OMT与钙通道阻断剂给药均使PSNL带来的IL-1β的变化出现显著逆转,而对HIF-α的水平无显著影响。DRG组织中,PSNL模型组小鼠的IL-1β和HIF-α水平显著升高(P<0.01),OMT及L-型钙通道阻断剂Nif单独给药对HIF-α水平无显著影响,OMT、N-型钙通道阻断剂CTX和L-型钙通道阻断剂Nif单独给药以及合并OMT与钙通道阻断剂给药均使PSNL带来的IL-1β和HIF-α的变化出现显著逆转(P<0.05)。7.N-、L-型钙通道介导的OMT对神经病理性疼痛模型小鼠步态行为指标影响的考察与PSNL模型组比较,OMT+CTX给药组、OMT+Nif给药组均可使SFI显著上调(P<0.01),在手术侧后足的足印相关四项指标中,OMT+CTX给药组、OMT+Nif给药组各指数均显著上调(P<0.05),同时,OMT+CTX与OMT+Nif联合给药相比,OMT+Nif给药组使足印面积指标下降更显著(P<0.01)。在手术对侧前足的步态分析参数中,OMT+CTX给药组、OMT+Nif给药组的足印相关四项指标均显著下调(P<0.05),平衡相关四项指标均显著上调(P<0.05),身体协调性相关指标未见统计学差异(P>0.05)。结论:1.OMT有利于神经病理性疼痛小鼠的坐骨神经功能指数恢复,对神经病理性疼痛小鼠的手术侧后足的足印相关指标、平衡相关指标有改善作用,对正常步序比及手术侧后足的身体协调性无影响。坐骨神经部分结扎术造成的手术侧后足疼痛可引起小鼠重心压力向对侧前足转移,OMT给药对手术侧后足疼痛具有改善作用,使该现象逆转并趋于正常。2.OMT抑制了N-、L-型钙通道激活剂产生的钙离子内流的现象。两种钙通道阻断剂单独使用,以及OMT与之分别合用,对PSNL造成的DRG细胞内钙离子浓度升高均有抑制作用,提示OMT可能通过阻断N-、L-型钙通道发挥镇痛作用。3.OMT和N-、L-型钙通道阻断剂对PSNL引起的脑、脊髓、DRG组织中的GABA和5-HT的变化有显著调控作用,合用N-或L-型钙通道阻断剂能加强OMT的调控作用。OMT及N-或L-型钙通道阻断剂均呈现显著抑制PSNL引起的DRG组织中p-物质升高的作用。同时,OMT在DRG组织中对N-、L-型钙通道激活剂引起的GABA、5-HT水平的变化有调控作用。因此推断OMT对PSNL小鼠的GABA和5-HT水平的改变可能与其对N-、L-型钙通道调控作用有关,对DRG组织中p-物质水平的改变也与N-、L-型钙通道作用有关。4.OMT对于N-、L-型钙通道激活剂引起的IL-1β水平升高具有抑制作用。OMT和N-、L-型钙通道阻断剂对PSNL引起的小鼠脑、脊髓、DRG组织中的IL-1β水平变化有显著调控作用(除脊髓中L-型钙通道阻断剂单独给药外),对HIF-α的变化没有影响,提示OMT调控PSNL的细胞炎性因子IL-1β水平的作用与N-、L-型钙通道阻断有关而HIF-α的变化与N-、L-型钙通道无关。5.在未影响小鼠身体协调性的情况下,OMT+CTX、OMT+Nif对神经病理性疼痛模型小鼠的步态行为有明显改善及纠正作用,但与OMT单独给药相比并无显著差异,说明合并OMT与N-型钙通道阻断药CTX或L-型钙通道阻断药NIF给药作用没有增强或减弱,提示OMT对PSNL小鼠步态分析参数的改善作用可能与CTX或Nif相似,通过调控N-或L-型钙通道而发挥作用。