研究背景及意义热射病(heat strok,HS)是一种死亡率极高的重症中暑,患者的核心温度(core temperature,Tc)通常高于40℃,并有中枢神经系统异常,重者常出现全身系统性炎症(systemic inflammatory response Syndrome,SIRS)、多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)等严重并发症。中枢神经损害是热射病主要临床特征,多表现为认知功能减退、共济失调、澹妄、惊厥、昏迷等。由于热射病脑损伤因发生时间早且危害大,已成为热射病损伤防治关注的焦点。有关热射病脑损伤的机制,已有研究证明热刺激可直接损伤脑细胞及其内部结构,诱导神经细胞凋亡或坏死。除了热应激直接引起中枢神经系统损伤外,近年来有学者提出热射病脑损伤的发生可能与中枢神经炎症相关。热射病可引起SIRS,全身多个组织脏器发生严重炎症反应,中枢神经系统观察到也有炎症反应发生,炎症介质可使细胞功能受损并加速神经元凋亡,使热射病患者预后欠佳,可发生认知功能障碍、记忆力减退以及精神失常等。但是热射病中枢神经炎症反应究竟是继发于外周炎症反应,还是高热刺激直接引起中枢神经系统原发性炎症反应,目前还缺乏深入研究。而这对于指导临床救治热射病,减轻中枢神经损伤具有重要意义。热射病的高死亡率与病程中发生MODS相关,中暑的病理生理学机制目前仍未完全清楚阐明,近年来研究发现热射病的病理生理过程与内毒素血症极为相似。热射病后血清中内毒素浓度升高,可导致单核巨噬细胞及中性粒细胞的活化,分泌TNFα、IL-1β、IL-6等炎症因子,并呈级联放大瀑布效应,促使SIRS的发生,进而出现MODS,损害多个器官的正常功能。但内毒素是否来源于肠道、肠源性内毒素血症是否是导致SIRS发生的主要机理目前仍存在争论。血脑屏障和肠道屏障是隔绝脑组织、肠道内容物与外周血液的重要结构。正常情况下血脑屏障可阻断有害的物质通过血液进入脑组织,如果血脑屏障结构破坏,通透性增高,外周血中炎症介质进入中枢神经系统,可引起继发性中枢炎症反应。而肠道屏障则是防止肠道内细菌及其产生的有害物质进入外周血。因此观察热射病后血脑屏障及肠道屏障的损伤程度、随时间的变化规律以及损伤后对中枢和外周炎症所产生的影响,对揭示中枢神经系统炎症、外周炎症的病理生理机制以及相互关系具有重要作用。因此,本课题旨在通过建立热射病脑损伤模型,研究热射病后中枢神经系统炎症和外周炎症的变化情况,以及在此过程中血脑屏障及肠道屏障的损伤程度及变化规律,以揭示中枢神经系统炎症、外周炎症的病理生理机制及相互关系,为临床救治热射病脑损伤提供新的参考依据。研究方法1,使用健康BALB/c小鼠,12周龄,雄性,重量(29.1±0.6)g,在(41.2±0.5)℃,湿度(60±2)%中持续暴露至小鼠直肠温度(rectaltemperature,Tre)达到(42.4±0.2)℃建立热射病小鼠模型,Tre表示其核心温度。小鼠分成正常对照组(CON)、热射病恢复1 h组(HS-1h)、热射病恢复6 h组(HS-6h)和热射病恢复24 h组(HS-24h)。对比观察各组小鼠在高温模拟舱中及热射病后的表现,舱室内及出舱后Tre变化和生存率情况,利用HE染色和透射电镜(transmission electron microscope,TEM)观察大脑组织病理变化。2,通过实时定量荧光PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组小鼠大脑皮层及海马TNF-α、IL-1β和IL-6基因及蛋白表达,探讨热射病后各恢复时相点大脑炎症的变化情况。3,通过ELISA检测各组小鼠外周血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量,鲎试剂动态浊度法测定各组小鼠血清中内毒素,探讨各恢复时相点血清内毒素与炎症的相关性;利用qPCR检测各组小鼠脾脏炎症因子的表达,系统评价热射病恢复期的外周炎症反应。4,通过HE染色和TEM观察各组小鼠血脑屏障及肠道屏障结构相关的病理变化,伊文思蓝(evans blue,EB)含量测定以及免疫印迹试验(western blot,WB)检测基质金属蛋白酶2(matrix metalloprotein,MMP-2)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein,MMP-9)表达,反映小鼠血脑屏障的通透性变化,FITC标记葡聚糖4(FITC-Dextran4,FD4)透过率检测,反应热射病后各组小鼠肠道屏障的通透性变化。结果1,在(41.2±0.5)℃、湿度(60±2)%环境中持续暴露至小鼠Tre达(42.4±0.2)℃建立了小鼠热射病模型,并按照热射病后不同恢复时相点分为CON组、HS-1h组、HS-6h组和HS-24h组;舱内小鼠出现躁动、脱水、澹妄至活动减少甚至昏迷,出舱后HS-1h组小鼠Tre明显降低,表现为低体温期,HS-24h组小鼠Tre略高于CON组,表现为发热期;HE染色和TEM在热射病小鼠观察到细胞周围水肿、细胞核固缩裂解、内质网紊乱等,表明热应激导致小鼠中枢神经细胞出现明显病理变化,热射病中枢神经损伤小鼠模型成功建立。2,HS-1h组、HS-6h组小鼠大脑皮层和海马炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表达及蛋白合成明显增多,与CON组相比较差异明显(P<0.01),HS-24h组小鼠大脑皮层和海马炎症因子与CON组无明显差异(P>0.05),提示热射病恢复期6h内中枢神经系统有明显炎症反应,以恢复期1 h最为严重,在24 h基本恢复正常水平。3,与CON组比较,HS-1h组、HS-6h组和HS-24h组小鼠外周血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和内毒素浓度明显升高,差异有统计学意义(P<0.01),在HS-1h组的炎症因子和HS-6h组的内毒素浓度最高,之后逐渐下降,但到24 h后仍高于对照(P<0.01);热射病各组小鼠脾脏炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达均高于CON组(P<0.01),在恢复1 h达到最高,变化趋势与外周血清基本一致,结果提示热射病恢复期24 h内持续出现明显的外周炎症反应。4,HE染色和TEM观察到了大脑微血管周围水肿以及血管管腔的压迫、血管内皮细胞连接不紧密以及肿胀和内皮消失,在小肠粘膜发现肠绒毛变短、稀疏、绒毛缺失,说明热射病对小鼠血脑屏障和肠道屏障结构造成了病理损伤;在HS-1h组、HS-6h组小鼠大脑MMP-2、MMP-9蛋白合成显著增多,与CON组相比差异明显(P<0.01),HS-24h组有所恢复,但仍然高于CON组(P<0.01);HS-1h组和HS-6h组小鼠EB在大脑中含量与CON组相比明显增多(P<0.01),HS-24h组仍高于CON组(P<0.01),说明热射病恢复期24 h内小鼠血脑屏障的破坏,透通性增高;HS-1h组、HS-6h组和HS-24h组小鼠血清FD4浓度明显增加,与CON组比较有统计学意义(P<0.01),提示热射病使小鼠肠道屏障透通性增高且一直持续至24 h。全文结论1.热射病后恢复期6 h内中枢神经系统出现明显的炎症反应,至24 h基本恢复正常。中枢神经炎症与热射病中枢神经损伤密切相关。2.热射病导致肠道屏障的结构破坏和通透性增加,肠道中内毒素可能通过肠道屏障进入血液循环,致使热射病后恢复期24 h内均发生明显外周炎症反应。3.热射病导致血脑屏障的结构破坏和通透性增加,热射病恢复期6 h内,外周炎症可能因为血脑屏障通透性增加从而影响中枢炎症的发生,但热射病恢复期24 h,中枢神经炎症表现为独立的发展进程,未受外周炎症的影响。